Molécules semblables au vorinostat en tant qu’outils structuraux, stéréochimiques et pharmacologiques

Molécules semblables au vorinostat en tant qu’outils structuraux, stéréochimiques et pharmacologiques

Malgré les progrès significatifs réalisés dans la recherche HDAC, 1 − 4 la recherche d’inhibiteurs sélectifs d’isoformes continue de présenter un défi majeur. 5 − 7 À ce jour, des informations biostructurales détaillées sont disponibles seulement pour quelques-unes des 11 métallo-enzymes connues.1,8 − 11 En conséquence, la conception des inhibiteurs sélectifs des isoformes et des classes est quelque peu arbitraire et dérivée.1,7,12 − 14 De plus, des données complètes concernant le profil HDAC factuel pour la plupart des agents découverts au début ne sont pas disponibles, le développement de dosages efficaces à base d’isozymes est relativement récent.5 − 7,15 − 18 En raison de la nature complexe et pléiotropique du cancer, des inhibiteurs d’HDAC promiscueux tels que Vorinostat (1) (SAHA, acide suberoylanilide hydroxamique) ) 19 (Figure &#x 200B; (Figure1) 1) semblent supérieurs et aussi sûrs en clinique que les quelques agents spécifiques à la classe disponibles. − 7,15Figure 1 Structure du Vorinostat (SAHA) et de l’analogue ω -alcoxy 2. Les approches basées sur le ligand sont une solution de premier choix pour délimiter les exigences structurelles pour la sélectivité HDAC, en particulier avec l’émergence des hydroxamates d’alcanoyl ω -aryle tels que Vorinostat en tant que candidats cliniques.1,7,12 − 14 Dans ce Les substituts simples et facilement accessibles méritent d’être étudiés, à condition qu’ils portent des déterminants pharmacophoriques aussi proches que possible d’un consensus sous-structural commun maximal requis pour cibler l’ensemble du panel HDAC. L’inclusion judicieuse d’appendices spécifiques capables d’interagir avec des résidus spécifiques dans la région de capuchon des HDAC peut fournir des informations structurelles, fonctionnelles et stéréochimiques précieuses sur la conception de nouveaux inhibiteurs.Dans une étude précédente, nous avons déterminé la longueur de chaîne alkyle optimale pour l’activité contre une seule isoforme, HDAC2.20 Conçu pour comprendre le rôle de la chiralité dans les analogues simples et analogues de Vorinostat, le composé (R / S) -2 est apparu comme une piste prometteuse pour son activité cytotoxique préliminaire contre les lignées cellulaires de leucémie, de colon et de poumon. Ici, nous décrivons les détails de la synthèse améliorée et raccourcie de 2, ainsi que les connaissances biostructurales à travers la modélisation moléculaire et une étude préliminaire de son activité in vitro contre un panel élargi de HDACs.Bien relativement simple dans la conception, les neuf étapes précédentes La synthèse du racémique 2 (20) a été raccourcie et adaptée pour produire du matériel à l’échelle de Gram pour des études pharmacologiques (Information à l’appui) (Schéma 1). La chaîne de carbone (R / S) -2 requise a été assemblée par une réaction de métathèse croisée21 entre un excès d’acrylate de méthyle et l’oléfine 3, facilement disponible à partir de (R / S) -glycidol, 22 en présence de Grubbs ‘. catalyseur de seconde génération dans CH2C12 à 40 ° C; La réduction catalytique en ester méthylique 4, suivie de la O-alkylation assistée par Sc (OTf) 3 avec le trichloroacétimidate de PMB, 23 conduit à 5. Cette substance a été déprotégée avec du TBAF et le produit a été soumis à une oxydation de Swern pour obtenir l’aldéhyde 6 en 94 % de rendement pour deux étapes. L’oxydation de 6 de Jones a conduit à l’intermédiaire d’acide carboxylique, qui a été immédiatement couplé sous forme brute avec de l’aniline en présence du réactif de Goodman (DEBPT) 24, conduisant à l’anilide 7 avec un rendement de 75%. Finalement, la conversion en acide hydroxamique (R / S) -2 a été facilement réalisée en traitant l’ester méthylique 7 avec de l’hydroxylamine et du NaOH dans du MeOH. L’énantiopure 2 peut être obtenue à partir de (R) – ou (S) -3 ou par inversion de Mitsunobu de la configuration des alcools individuels.20 En utilisant ce protocole, la synthèse de (R / S) -2 a été réalisée en sept étapes à partir de 3 à 37% de rendement global.Schéma 1Synthèse de ω -Alkoxy Analogue 2Dans les tests préliminaires contre le test HDAC immunopurifié HeLa, 20 (R / S) -2 ont montré une puissance nanomolaire comparable sinon améliorée sur Vorinostat. Étonnamment, aucune différence significative dans l’activité inhibitrice n’a été trouvée entre (R / S) -2 et ses énantiomères individuels contre cette isoforme HDAC.25 Une évaluation antiproliférative subséquente contre trois différentes lignées de cellules cancéreuses humaines (NB4, H460 et HCT-116) prouvée le potentiel de 2 en tant que candidat prometteur pour un profilage supplémentaire. L’activité de racémiques et d’énantiopures 2 pour inhiber 11 isozymes HDAC humaines isolées en présence d’un peptide fluorogène lié au fragment RHKK (Ac) de p53 (résidus 379 et 382). ) comme le substrat est montré dans le tableau 1.18 Vorinostat, 19 trichostatine A (TSA), 26 et NVP-LAQ82427 ont été utilisés comme composés de référence.Tableau 1In activité inhibitrice de Vitro de Racemic et Enantiopure 2 contre HDAC1 − 11 Isoformes (IC50, nM ) aDe cette étude, nous avons confirmé le rôle de 2 en tant qu’inhibiteur de la promiscuité, présentant une activité comparable à celle de Vorinostat contre tous les HDAC. Aucune différence significative n’a été trouvée entre le racémique 2 et ses énantiomères individuels, qui se sont avérés être équipotents contre tous les HDAC dépendants du zinc. Pour mieux comprendre cette équivalence, une analyse d’amarrage des énantiomères individuels de 2 a été réalisée sur la base des structures cristallines de HDAC88 et de HDAC7,9 qui ont été choisies comme représentants des HDAC de classe I et II, respectivement (Figure ​ Figure 22) .28 Lors de la liaison de ces isoformes, un arrangement en forme de T a été observé pour les deux énantiomères du ligand 2, qui projetaient ses motifs aromatiques à partir du canal actif vers des poches lipophiles situées dans des directions opposées sur la surface de l’enzyme. On a trouvé que des résidus dans le bord de HDAC8 se liaient aux interactions anilide ou p-méthoxybenzyle de chaque énantiomère Les distances relatives entre chaque résidu Phe et les fragments aromatiques de Les deux énantiomères, ainsi que le nombre correspondant d’interactions, sont présentés dans le tableau 2.29 La somme des interactions produites par les énantiomères (S) et (R) de 2 avec les deux Phe resid ue a été trouvé être presque le même dans HDCA8. Globalement, 13 interactions ont été détectées dans le cas de (S) -2, et 11 dans le cas de (R) -2, ce qui peut expliquer la légère différence observée par les énantiomères dans la liaison de cette isoforme [IC50 (R) / (S) = 3,3]. La liaison a été davantage stabilisée par des interactions entre les liaisons amide des isomères (R) et (S) avec une molécule d’eau conservée ainsi qu’avec un résidu Asp conservé (Asp101 dans HDAC8). En outre, une liaison H entre le groupe méthoxy de l’isomère (S) et le Lys33 dans HDAC8 a contribué à la stabilisation du complexe. Ce résidu Lys est particulier à HDAC88 et peut également jouer un rôle dans la petite différence d’activité entre les énantiomères. Figure 2 Gauche: meilleures solutions d’amarrage de (S) -2 (jaune) et (R) -2 (vert) sur cristal HDAC8 structure.28 À droite: meilleures solutions d’ancrage de (S) -2 (jaune) et (R) -2 (vert) sur la structure cristalline HDAC7.28 Les liaisons H entre les ligands et l’enzyme sont indiquées en pointillé … Tableau 2 π − π Distances d’Interaction (Å) et Nombre d’Interactions29 entre les Anneaux Aromatiques de (S) – et (R) -2 et les Résidus Phe dans la Bordure des liaisons HDAC8 (Phe208 et Phe152) et HDAC7 (Phe738 et Phe679) à HDAC7, des interactions analogues ont été observées dans le bord de cette isozyme, impliquant Phe738 (Phe208 dans HDAC8), Phe679 (Phe152 dans HDAC8), et les groupes aromatiques des deux énantiomères de 2. Dans ce cas, trois et quatre π − π les interactions stabilisant le complexe de (S) – et (R) -2, respectivement, via leurs cycles anilide et PMB, ont été enregistrées par rapport à HDAC8 (Tableau 2). Une molécule d’eau conservée stabilise les isomères par des interactions avec l’amide et les liaisons éther de (S) -2 et (R) -2, respectivement. Une interaction a été trouvée entre l’Asp626 et la liaison amide de (R) -2, ce qui pourrait expliquer son activité marginalement supérieure par rapport à l’énantiomère (S) [IC50 (S) / (R) = 3,4]. En outre, plus loin π − π des interactions ont été observées entre Phe737 et le cycle PMB de (R) -2 et le motif anilide de (S) -2, renforçant également la liaison des deux énantiomères. Malgré les différents sites d’interaction de liaison observés pour les deux isomères de 2 contre ces HDAC, les niveaux de leur activité inhibitrice n’ont pas été sensiblement modifiés. Dans l’ensemble, leur mode de liaison suggérait que les interactions lipophiles avaient un rôle majeur dans la stabilisation de leurs complexes individuels30. Notre hypothèse est en partie confirmée par une comparaison structurelle détaillée entre HDAC1 et HDAC8.31 Considérant le haut niveau de conservation des résidus Phe parmi les isoformes HDAC, ces interactions pourraient expliquer le manque de discrimination entre les énantiomères individuels. On a récemment fait valoir que l’activité enzymatique associée aux HDAC de classe IIa exprimée de façon ectopique dans les cellules de mammifères pourrait être le résultat d’une contamination résiduelle par En raison de cette possibilité, nous avons jugé nécessaire d’étendre notre test pour inclure cette méthode de profilage HDAC avec (R / S) -2. Le test in vitro a été réalisé en présence du substrat fluorogénique spécifique à la classe IIa acétyl-Lys (trifluoroacétyl) -AMC, en utilisant Vorinostat et TSA comme composés de référence (tableau 3, voir également les informations de support). Compte tenu de la faible sensibilité de ce substrat, une diminution remarquable de l’activité de tous les composés testés a été observée, qui était dans la gamme micromolaire. Pour cette raison, les deux énantiomères de 2 n’ont pas été testés. Bien que le composé (R / S) -2 ait été trouvé aussi actif que Vorinostat contre HDAC7 et HDAC9, et légèrement moins actif contre HDAC5, il était totalement inactif vis-à-vis de HDAC4. Ainsi, une différence spectaculaire a été observée entre les activités de (R / S) -2 et Vorinostat dans le test spécifique de classe IIa contre HDAC4, par rapport aux résultats présentés dans le tableau 1 dans le test de profilage de classe I-II-IV. Comme suggéré par le groupe Gallinari 16, ceci pourrait être dû à la présence d’une activité de désacétylase résiduelle provenant des HDAC contaminants de classe I dans les essais de profilage traditionnels. La généralité de cette observation doit être validée par un examen minutieux des substrats appropriés et de la pureté des isoenzymes recombinantes permettant un profil HDAC précis.3,5 − 7,15 − 17Table Activité inhibitrice in vitro de (R / S) -2 contre les isoformes HDAC de classe IIa (IC50, μ M) aLes essais préliminaires ont été réalisés sur (R / S) -2 pour évaluer son absorption et son métabolisme. Des cellules dérivées du carcinome colorectal humain (lignée cellulaire Caco-2) ont été utilisées comme modèle in vitro pour prédire l’absorption (R / S) -2 dans l’intestin humain.32 Une étude de transport a été réalisée pour obtenir des coefficients de perméabilité apparents ( Papp) dans la direction apicale à basolatérale, et le résultat a été comparé à Vorinostat et aux composés de référence cimétidine, vinblastine et caféine (Informations à l’appui). Selon ce modèle, une forte perméabilité intestinale peut être prédite pour des coefficients Papp supérieurs à 50. Dans ce test, un bon niveau d’absorption orale a été prédit pour (R / S) -2, qui a montré une valeur Papp supérieure à Vorinostat (Papp). = 219,2 vs Papp = 77,6 nm / s) et comparable à la caféine (Papp = 312,4 nm / s). L’étude du métabolisme a été réalisée après incubation de (R / S) -2 avec des hépatocytes cryoconservés humains (HC2 et H655) et par la suite quantification du composé parent restant à partir du surnageant incubé par UPLC.33 La stabilité métabolique a été définie comme le pourcentage de composé parent perdu au fil du temps dans le système de test actif. Le vorinostat a été utilisé comme composé de référence, avec la 7-éthoxycoumarine et la 7-hydroxycoumarine comme témoins positifs de la compétence des hépatocytes pour le métabolisme des phases I et II, respectivement (0,42% après 90 min à 1 μ concentration en M et 2,08% laissé dans les mêmes conditions).33 Bien qu’une plus faible stabilité ait été observée pour (R / S) -2 par rapport à Vorinostat (23% restants après 90 min à 1 μ concentration de M contre 61% dans les mêmes conditions pour Vorinostat), des mesures pour améliorer son En conclusion, nous avons étudié les effets structuraux et stéréochimiques d’un analogue α-alcoxy optimisé de Vorinostat en tant que sonde pour évaluer son profil d’activité in vitro contre 11 isoformes. d’HDAC. Bien qu’une perméabilité supérieure ait été notée pour le composé 2 dans le test Caco-2 par rapport au Vorinostat, un taux de métabolisme plus rapide a été observé. Il est possible qu’une O-déméthylation ou une oxydation du carbone benzylique ait lieu, ce qui pourrait être évité avec des modifications appropriées du groupe fonctionnel. Les résultats concernant ces variations et d’autres seront divulgués en temps voulu.