Structure basée sur des inhibiteurs de STAT3 perméables aux cellules et contraints par la conformation

Structure basée sur des inhibiteurs de STAT3 perméables aux cellules et contraints par la conformation

STAT3, le signal transducteur et activateur de la transcription 3, est un facteur de transcription qui transmet les signaux directement des récepteurs de surface cellulaire au noyau1. Il a été démontré que l’activation persistante de la signalisation STAT3 contribue directement à l’oncogenèse en stimulant la prolifération cellulaire et en empêchant l’apoptose dans les cellules cancéreuses humaines. L’activation de STAT3 procure non seulement un avantage de croissance aux cellules tumorales, permettant leur accumulation, mais confère également une résistance aux thérapies conventionnelles qui reposent sur la machinerie apoptotique pour éliminer les cellules tumorales.1 − 7 STAT3 est donc un attractif cancer thérapeutique target.1 − 8STAT3 est recruté à partir du cytosol et a des interactions spécifiques à travers son homo Src logy 2 (SH2) domaine avec différents récepteurs de cytokine possédant des sites d’accueil phosphotyrosine. STAT3 devient ensuite phosphorylé sur une tyrosine carboxy-terminale, et cette phosphorylation provoque sa dimérisation, sa translocation dans le noyau et sa liaison à des séquences promotrices spécifiques sur ses gènes cibles. Cette dimérisation de STAT3 est décisive pour son activation.7,8 Ainsi, il a été proposé que les inhibiteurs de petites molécules qui lient le domaine SH2 de STAT3 peuvent bloquer son interaction avec les récepteurs de cytokines, ainsi que son homodimérisation, conduisant à une inhibition efficace de Son activité.9 Des efforts considérables ont été déployés dans la conception d’inhibiteurs peptidiques et non peptidiques ciblant le domaine SH2 dans STAT3.9. Bien que les inhibiteurs à base de peptides puissent se lier à STAT3 avec de fortes affinités, ils souffrent du manque de la perméabilité cellulaire due à la fois à leur nature peptidique et aux charges négatives sur le groupe phosphotyrosine. D’autre part, les inhibiteurs de petites molécules non peptidiques sont perméables aux cellules, mais la plupart des composés rapportés se lient à STAT3 avec de faibles affinités et l’activité cellulaire ne peut pas être clairement attribuée au ciblage STAT3. Récemment, McMurray et ses collègues ont rapporté la conception réussie de peptidomimétiques perméables aux cellules qui inhibent l’activité de STAT3 dans les cellules en utilisant une stratégie de promédicament.26 Malgré ces efforts, la conception d’inhibiteurs de STAT3 puissants et perméables aux cellules reste une tâche très difficile.Dans cette étude, nous rapportons la conception basée sur la structure, la synthèse et l’évaluation d’une nouvelle classe d’inhibiteurs peptidomimétiques sous contrainte conformationnelle de STAT3. Nos efforts ont produit un ensemble de composés qui se lient à STAT3 avec de hautes affinités. De plus, en incorporant une longue chaîne hydrocarbonée dans un ligand STAT3 pour améliorer la perméabilité cellulaire, nous avons obtenu avec succès un inhibiteur de STAT3 puissant et perméable aux cellules. Nous avons déjà rapporté la conception et la synthèse du composé 1 (Figure 1). , 1), à partir de l’hexapeptide phosphorylé (pYLPQTV) dérivé de la séquence de la protéine gp130.25 Le composé 1 se lie à STAT3 avec une valeur Ki de 350 nM.25 L’examen du modèle de liaison prédit pour 1 dans un complexe avec STAT3 suggère que l’isobutyle le groupe de la leucine peut être cyclisé avec le cycle à cinq chaînons de la proline pour former le lactame bicyclique sans déformer la conformation de tour de 1 (figure 2) (figure 2) .2). Ceci a conduit à la conception du composé 2.Figure 1A, un peptide et des peptidomimétiques conçus conformationnellement sous contrainte. Figure 2 Mode de liaison réduit pour le composé 1 (A) et le composé 2 (B). Carbone en gris, violet et cyan pour la protéine, composé 1 et composé 2, respectivement. L’azote, l’oxygène, le soufre et le phosphore sont indiqués en bleu, rouge, jaune et orange, respectivement. Protéine … Le composé 2 a été synthétisé (information de support) et déterminé pour avoir une valeur de Ki de 17 nM à STAT3 dans notre essai compétitif, basé sur la fluorescence-polarisation (FP) (figure 33 et informations de support). Par conséquent, le composé 2 est 20 fois plus puissant que le peptide initial 1, représentant un composé principal puissant pour d’autres études de la relation d’activité de structure.Les courbes de liaison compétitives des composés conçus à la protéine STAT3 sont déterminées dans un essai de liaison basé sur FP et Leurs valeurs Ki et écarts-types Pour chaque composé, 3 expériences indépendantes ont été réalisées en fonction de l’optimisation … Des études antérieures ont montré que le résidu Gln est d’une importance critique pour la liaison des inhibiteurs à base de peptides STAT3. 10 Les composés 3 et 4 ont donc été conçus pour étudier plus avant l’importance de la chaîne latérale du résidu Gln dans le composé 2 pour la liaison à STAT 3. Lorsque la chaîne latérale Gln dans 2 est remplacée par un groupe méthyle o Dans le cas d’un groupe éthyle, les valeurs de Ki des composés résultants 3 et 4 sont de 3,23 μ M et de 8,57 μ M, respectivement. Ainsi, les composés 3 et 4 sont respectivement 190 et 500 fois moins puissants que 2. Lorsque le groupe carbonyle amide du résidu Gln est réduit, le composé résultant 5 se lie à STAT3 avec une valeur de Ki de 207 nM, étant 10 fois moins puissant que 2. Lorsque le résidu Gln est remplacé par un résidu His, le composé résultant 6 Pris ensemble, ces données montrent clairement que les deux groupes carbonyle et amino dans la chaîne latérale du résidu Gln apportent des contributions significatives à la liaison du composé 2 à STAT3. Pour étudier si le groupe Cbz dans 2 contribue à sa liaison à STAT3, il est remplacé par un groupe acétyle. Le composé résultant 7 a une valeur de Ki de 15 nM et est donc équipotent avec 2, indiquant que le groupe Cbz dans 2 n’apporte aucune contribution significative. Nous avons évalué la capacité des composés 2 à inhiber la croissance cellulaire dans MDA-MB-. 231 et MDA-MB-468, deux lignées cellulaires de cancer du sein humain avec des niveaux très élevés de STAT3 phosphorylée. A notre grande déception, aucun de ces composés ne présente d’activité cellulaire à des concentrations aussi élevées que 100 ° C, à l’exception du composé 3, qui présente une faible activité. Dans un effort pour surmonter le manque d’activité cellulaire du composé 7, nous avons introduit une longue chaîne lipidique à son extrémité N-terminale. Le composé résultant 8 a une valeur de Ki de 10 nM et est aussi puissant que le composé 7. Le composé 8 inhibe de manière dose-dépendante la croissance cellulaire dans les lignées cellulaires MDA-MB-231 et MDA-MB-468 avec des valeurs CI50 de 25 et 35 μ M, respectivement (Informations de support) .Bien que le groupe amide dans la chaîne latérale Gln dans le composé 8 soit clairement important pour la liaison à STAT3 sur la base des données pour les composés 2 et 6, le groupe amide primaire peut être préjudiciable pour perméabilité cellulaire. Nous avons donc conçu 9 dans lequel le résidu Gln est remplacé par l’histidine. Le composé 9 se lie à STAT3 avec une valeur de Ki de 458 nM, et est donc 45 fois moins puissant que 8. Cependant, le composé 9 a une activité similaire au composé 8 dans l’inhibition de la croissance cellulaire à la fois dans le MDA-MB-231 et le MDA- MB-468 lignées de cellules cancéreuses (informations de soutien), avec des valeurs IC50 de 50 et 70 μ M, respectivement. Ces données suggèrent que le résidu Gln est en effet préjudiciable à la perméabilité cellulaire de nos ligands STAT3. Les composés 8 et 9 portent des charges négatives dues à leur groupe phosphotyrosine.Nous avons ensuite étudié si le remplacement d’un atome de carbone dans le cycle de ces composés par un azote chargé positivement, ce qui réduit la charge négative globale de la molécule entière, peut améliorer leur activité cellulaire sans effet négatif significatif sur leur liaison à STAT3 . Les composés résultants 10 et 11 ont des valeurs de Ki de 45 nM et de 950 nM, respectivement, à STAT3, et sont donc 2 fois moins puissants que leurs équivalents 8 et 9. D’où l’introduction d’un azote chargé positivement dans le 8. anneau -membered a un effet négatif modeste sur leur liaison à STAT3. Les 10 et 11 inhibent de manière dose-dépendante la croissance cellulaire dans les lignées de cellules cancéreuses MDA-MB-231 et MDA-MB-468 (informations complémentaires). Alors que 10 n’est que légèrement plus puissant que 8, le composé 11 est 5 fois plus puissant que le composé 9 dans les deux lignées cellulaires cancéreuses. Le composé 11 atteint les valeurs IC50 de 11,2 μ M et 3,6 μ M, respectivement, dans les lignées de cellules cancéreuses MDA-MB-231 et MDA-MB-468 (Informations de Support), respectivement, dans l’inhibition de la croissance cellulaire Pour déterminer si l’azote chargé positivement dans le cycle de 8 membres est important pour l’activité cellulaire, nous avons synthétisé le composé 12, dans lequel le groupe méthyle est remplacé par un groupe acétyle. Alors que le composé 12 se lie à STAT3 avec une valeur de Ki de 0,76 μ M, similaire à celle du composé 11, il est 10 fois moins puissant que 11 dans le test de croissance cellulaire dans le MDA-MB-231 et MDA-MB-468 lignées de cellules cancéreuses.Il a été émis l’hypothèse que l’inhibition directe de l’activité STAT3 dans les cellules tumorales peut conduire à l’induction de l’apoptose.3 − 5 Nous avons ensuite évalué le composé 11 pour sa capacité à induire l’apoptose dans le MDA-MB -468 ligne de cellules cancéreuses. Comme on peut le voir sur la figure 4, le composé 11 induit efficacement l’apoptose d’une manière dépendant de la dose et du temps. Par exemple, le composé 10 à 10 ° C pendant 24 et 48 heures induit une apoptose de 26% et 35% des cellules cancéreuses du sein MDA-MB-468, respectivement. MDA-MB-468 lignée cellulaire. Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de 11 pendant 24 ou 48 h, et l’apoptose a été analysée en utilisant l’annexine V et la double coloration à l’iodure de propidium par cytométrie de flux. Pourcentage … Pour tester si 11 peut inhiber efficacement l’activité de STAT3 et induire l’apoptose à des concentrations et à des moments similaires, nous avons examiné un certain nombre de marqueurs moléculaires dans les cellules cancéreuses MDA-MB-468. Comme le montrent les figures 5 et 5, le composé 11 induit le clivage de la caspase-3 et de la PARP, deux marqueurs biochimiques de l’apoptose critique d’une manière dépendante de la dose et du temps. Le composé 11 induit un clivage robuste de la caspase-3 et de la PARP à 5 − 10 μ M pour un traitement de 2 jours. En accord avec son mécanisme d’action, le composé 11 réduit également efficacement les taux de protéine phospho-STAT3 à 5 ° C pendant 2 jours, sans affecter les niveaux de la protéine STAT3 totale. En outre, il diminue de manière significative les niveaux de protéines Bcl-xL et cycline D1, deux cibles transcriptionnelles connues de STAT3 à 10 μ M pour un traitement de 2 jours (Figure 55) .1 − les données cellulaires montrent clairement que le composé 11 inhibe efficacement l’activité STAT3 dans la lignée cellulaire cancéreuse MDA-MB-468 aux concentrations et aux points temporels auxquels une forte apoptose des cellules tumorales est induite.Figure 5Western analyse des marqueurs biochimiques pour l’induction et l’inhibition de l’apoptose de l’activité STAT3 par le composé 11 dans la lignée cellulaire MDA-MB-468 Les cellules ont été traitées avec 11 pendant 24 et 48 h, et les niveaux de STAT3, pSTAT3, PARP complet, PAPR clivé (Cl … En résumé, nous ont réussi à concevoir et à synthétiser une série d’inhibiteurs peptidomimétiques puissants de STAT3 dont la conformation est limitée.Plusieurs de ces composés se lient à STAT3 avec de faibles affinités nanomolaires .. De manière significative, le composé 11 se lie à STAT3 avec une valeur Ki de 0,95 μ cel l croissance avec des valeurs IC50 de 3 − 11 μ M dans deux lignées cellulaires de cancer du sein avec des niveaux élevés de phosphor-STAT3. Nos données montrent en outre que le composé 11 est efficace dans l’inhibition de l’activité de STAT3 et l’induction de l’apoptose dans la lignée de cellules cancéreuses MDA-MB-468 d’une manière dépendant du temps et de la dose. Par conséquent, le composé 11 est perméable aux cellules et est un inhibiteur de STAT3 de bonne foi. Le composé 11 représente donc un outil pharmacologique utile pour étudier le rôle de STAT3 dans les cellules cancéreuses, et constitue un composé prometteur pour une optimisation supplémentaire vers notre objectif de développer une nouvelle classe de médicaments anticancéreux en ciblant STAT3.