Études synthétiques et immunologiques de dérivés de sTn portant des acides phénylacétylsialiques substitués comme candidat vaccin contre le cancer

Études synthétiques et immunologiques de dérivés de sTn portant des acides phénylacétylsialiques substitués comme candidat vaccin contre le cancer

Il est bien établi que les cellules tumorales exprimer certains glycanes distinctifs, appelés antigènes glucidiques associés aux tumeurs (TACA), dont beaucoup sont des sialooligosaccharides qui portent l’acide N-acétyl sialique (NeuNAc) à l’extrémité non réductrice du glycane.1 − 3 Sialo-TACA sont des matrices moléculaires utiles dans le développement de vaccins anticancéreux ou d’immunothérapies contre le cancer.4 − 6 Par exemple, sialyl Tn (sTn, Figure ​ Figure1), 1), un sialo-disaccharide TACA abondamment exprimé par un certain nombre de tumeurs telles que le cancer du sein, de la prostate, colorectal, ovarien, pancréatique et gastrique, est une cible chaude.7 − 12 STn est relativement spécifique de la tumeur, et rarement observée dans les tissus normaux. 13,14 De plus, l’expression des cellules tumorales de sTn est généralement associée à un mauvais pronostic8 − 10,15,16 et est également un signe de progression maligne et métastatique.17,18 Par conséquent, un vaccin efficace basé sur sTn peut être très utile pour le traitement d’une variété de tumeurs métastatiques. Cependant, comme la plupart des TACA, le sTn est peu immunogène et ne peut provoquer une réponse immunitaire à médiation cellulaire T nécessaire pour l’immunothérapie anticancéreuse.19 Tente de surmonter ce problème par liaison covalente de sTn à des protéines porteuses, comme l’hémocyanine de Keyhole Limpet (KLH), ont obtenu un succès limité. Par exemple, bien que le conjugué sTn-KLH (Theratope) se soit avéré être assez immunogène et ainsi évalué comme vaccin thérapeutique contre le cancer du sein métastatique, 17,20 a malheureusement provoqué des réponses immunitaires humorales chez les patients cancéreux et a finalement échoué à la phase Pour traiter le problème d’immunogénicité faible des TACA, nous avons récemment développé une nouvelle stratégie pour l’immunothérapie du cancer, qui combine la vaccination en utilisant des vaccins constitués de TACA chimiquement modifiés avec l’ingénierie métabolique des TACA sur le marché. Nous avons démontré que les dérivés de TACA modifiés de manière non naturelle sont beaucoup plus immunogènes que leurs homologues naturels.22 − 24 En particulier, nos études immunologiques ont montré que le N-phénylacétyl sTn (sTnNPhAc, Figure ​ Figure1) 1) était le plus immunogène parmi un certain nombre de dérivés de N-acyl sTn étudiés jusqu’à présent et que sTnNPhAc Ainsi, sTnNPhAc est un candidat vaccin prometteur. Encouragé par les résultats de sTnNPhAc, nous avons cherché à évaluer dans cette recherche l’influence de modifications chimiques supplémentaires du cycle phényle de sTnNPhAc sur les propriétés immunologiques. des dérivés sTn résultants, de manière à caractériser la relation de réactivité de la structure et à identifier des candidats vaccins plus puissants. Dans ce contexte, nous avons conçu et synthétisé plusieurs dérivés de l’antigène sTn, y compris 5 ′ -Np-méthylphénylacétyle sTn (sTnNMePhAc), 5 ′ -Np-méthoxylphénylacétyle sTn (sTnNMeOPhAc), 5 ′ -Np-acétylphénylacétyle sTn (sTnNAcPhAc) et 5 ′ -Np-chlorophénylacétyle sTn (sTnNClPhAc) (Figure ​ (Figure2), 2), qui contiennent des donneurs d’électrons et des substituants électro-attractants, respectivement, ont couplé ces dérivés à KLH et ont évalué les propriétés immunologiques des glycoconjugués résultants la (Figure 22). Figure 2 Structures de dérivés de sTn synthétisés et de leurs glycoconjugués protéiques.La synthèse chimique des dérivés de sTnNPhAc conçus et de leurs conjugués de KLH et de sérumalbumine humaine (HSA) 1a et 2a et d) 2a (figure 2) (figure 2) est montré dans le schéma 1. La réaction de sialylation a été réalisée avec N-trifluoroacétyl thiosialoside 3 (26) en tant que donneur de glycosyle, en utilisant Le N-iodosuccinamide (NIS) et l’acide triflique (TfOH) en tant que promoteurs, pour donner un mélange de deux disaccharides anomères avec un bon rendement (66%) et en faveur du α un anomère (α / β 3.7 / 1). Cependant, les deux anomères étaient difficiles à séparer par Chromatographie sur colonne. Ce n’est qu’après avoir éliminé leur groupe isopropylidène avec de l’acide acétique à 65% dans l’eau que les diols résultants ont été facilement séparés pour offrir le disaccharide 5 lié souhaité avec un rendement de 52% (deux étapes globales). La configuration de α du résidu d’acide sialique dans 5 a été déterminée sur la base du décalage de champ observé du signal de RMN 1H de H-3 ′ e (δ 2,63, comparé à δ 2,42 de l’acide sialique lié à β La forte corrélation entre C-1 ′ et H-3 ′ a, mais pas H-3 ′ e, dans le spectre HMBC de 5, a confirmé en outre la configuration de α du résidu sialyle. Ensuite, un groupe penténoyle a été fixé à l’extrémité réductrice du glycane après la réduction sélective du groupe azido en 5 pour former une amine primaire, puis l’acylation sélective du groupe amino résultant avec l’anhydride penténoïque. Le groupe penténoyle a été utilisé comme une poignée moléculaire pour faciliter le couplage des antigènes glucidiques aux protéines porteuses.Finalement, les groupes N-trifluoroacétyle et O-acétyle dans 6 ont été éliminés par des traitements avec une solution méthanolique de NaOMe puis une solution aqueuse méthanolique de NaOH, et le groupe amino exposé a été sélectivement acylé dans du méthanol par des réactions avec p-méthylphénylacétique, p. respectivement, des anhydrides méthoxyphénylacétique, p-acétylphénylacétique et p-chlorophénylacétique, pour donner les dérivés sTnNPhAc 7a & d; Les produits 7a et 1212 ont été purifiés sur une colonne Biogel P2 en utilisant de l’eau désionisée comme éluant, et leurs structures ont été confirmées par spectrométrie RMN et SM de synthèse à haute résolution des dérivés de sTnNPhAc et de leurs conjugués protéiques 1a et 2a et # x02212; dLes antigènes glucidiques ont finalement été couplés à des protéines porteuses selon un protocole établi27. D’abord, 7a et 2212d ont été convertis en aldéhydes 8a & d02212; d après traitement à l’ozone dans du méthanol et les produits ont été purifiés sur une colonne Biogel P2. et caractérisé par spectrométrie RMN 1H, qui a montré la disparition des signaux de double liaison et l’apparition du signal d’aldéhyde hydraté à δ 5.2. Ensuite, 8a − d ont été liés à KLH et HSA par une amination réductrice réalisée dans du tampon NaHCO3 0,1 N en présence de NaBH3CN. Les glycoconjugués résultants la et 2a ont été purifiés sur une colonne Biogel A0.5, et le premier élément élué était les glycoconjugués désirés, qui étaient bien séparés des aldéhydes correspondants 8a et 1222 utilisés; en excès. Des fractions de colonne contenant des conjugués la et 2a et 2a et d, qui ont été testées pour contenir à la fois des hydrates de carbone et des protéines, ont été combinées, dialysées contre de l’eau déminéralisée, puis lyophilisées pour donner 1 − d et 2a &#x02212 d comme solides blancs pelucheux. Les niveaux de charge en antigènes des glycoconjugués 1a et 2a et d2a ont été déterminés d’après leurs teneurs en acide sialique analysées par la méthode au résorcinol comme décrit dans la littérature.28 Comme indiqué dans le tableau 1 des informations complémentaires, les conjugués KLH et HSA 1a − d et 2a − d contenu ca. 3 − 5 et 6 − 8% (w / w) des antigènes glucidiques, respectivement, qui étaient comparables à celle des glycoconjugués obtenus précédemment.23,24KLH conjugués 1a − d ont été évalués comme vaccins dans C57BL / 6 souris et comparé au conjugué KLH de sTnNPhAc, tandis que les conjugués HSA correspondants ont été utilisés comme antigènes de capture dans des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) des activités immunologiques de ces vaccins. En résumé, des groupes de cinq souris ont été individuellement immunisés avec une injection (im) intramusculaire d’une émulsion (un total de 0,1 ml) de 1a ou sTnNPhAc-KLH (contenant 2). μ g d’un antigène glucidique) et l’adjuvant Titermax Gold aux jours 0, 14, 21 et 28, respectivement. Les souris ont été saignées le jour précédant l’immunisation initiale et le jour 27 et le jour 37 après l’immunisation. Des échantillons de sang recueillis à chaque point temporel ont été coagulés pour la préparation d’antisérums par des protocoles décrits dans la littérature, 23,24 qui ont ensuite été stockés à − 80 ° Pour le test ELISA, après avoir enduit les plaques de sTn-HSA, de sTnNPhAc-HSA et de 2a et de d22 respectivement, elles ont été utilisées pour détecter les anticorps spécifiques de l’antigène correspondants.23,24 Les titres de l’anticorps total et de l’anticorps individuel les isotypes, tels que IgM, IgGl, IgG2a et IgG3, ont été analysés avec divers anti-anticorps. Le titre d’anticorps, défini comme le nombre de dilution du sérum auquel la valeur de densité optique (OD) d’une expérience ELISA atteint 0,5, a été obtenu à partir de la ligne de meilleur ajustement en traçant les valeurs de DO par rapport aux valeurs de dilution. les titres des antisérums du jour 37 étaient globalement beaucoup plus élevés que ceux des antisérums du jour 27, reflétant la tendance générale d’une réponse immunitaire accrue à une exposition récurrente aux mêmes antigènes, ce qui est souhaitable. Ici, nous ne présentons et ne discutons en détail sur les résultats ELISA de l’antisérum jour 37. La figure 33 montre les titres d’anticorps totaux des antisérums groupés en ce qui concerne chaque antigène spécifique. Clairement, tous les nouveaux conjugués la ont provoqué de fortes réponses immunitaires spécifiques de l’antigène, plus fortes que celles de sTnNPhA-KLH. De plus, il semble que les dérivés de sTnNPhAc avec des groupes attracteurs d’électrons attachés au cycle phényle, y compris sTnNAcPhAc et sTnNClPhAc, sont plus immunogènes que ceux avec des groupes donneurs d’électrons, tels que sTnNMePhAc et sTnNMeOPhAc. Que cette observation ait une signification générale n’est pas claire actuellement. Le sTnNClPhAc est particulièrement intéressant, car il contient le plus petit substituant parmi les quatre dérivés de sTn nouvellement conçus, mais il est le plus immunogène. Ces résultats indiquent que l’immunogénicité de ces dérivés de sTn est liée à la propriété générale des groupes N-acyl non naturels plutôt qu’à leur masse stérique par rapport à sTn ou sTnNPhAc.Figure 3 Titres d’anticorps spécifiques de l’antigène total dans les antiserums du jour 37 obtenus à partir de souris inoculées avec des conjugués sTnNPhAc-KLH, sTnNMePhAc-KLH (1a), sTnNMeOPhAc-KLH (1b), sTnNAcPhAc-KLH (1c) et sTnNClPhAc-KLH (1d) , respectivement. Pour ELISA, le … Pour évaluer la qualité des réponses immunitaires induites par les glycoconjugués 1a − d, nous avons analysé les titres de divers isotypes d’anticorps dans les antisérums du jour 37 par ELISA. Les résultats présentés sur la Figure 44 ont clairement démontré que les quatre conjugués provoquaient des titres élevés d’anticorps IgG1 chez toutes les souris de manière uniforme, tandis que les titres d’autres isotypes d’anticorps, tels que les anticorps IgM, IgG2a et IgG3, étaient très faibles. . En fait, les titres d’anticorps IgGl sur la figure 44 correspondent bien aux titres d’anticorps totaux dans la figure 33, ce qui a en outre prouvé que les anticorps IgG1 étaient principalement des anticorps IgG1. Les titres relativement faibles (mais toujours significatifs) d’anticorps IgM et les niveaux substantiellement élevés d’anticorps IgGl induits par les conjugués la, par rapport à sTnNPhAc-KLH, suggèrent un changement d’isotype d’anticorps potentiel, et des réponses immunitaires améliorées à médiation cellulaire T les nouveaux analogues de STT. Il est documenté que, après le traitement de l’antigène, la protéine porteuse des glycoconjugués peut fournir des peptides qui interagiront de manière non covalente avec les molécules du CMH de classe II et qui seront présentés aux cellules T auxiliaires. Les interactions des lymphocytes T auxiliaires avec les lymphocytes B spécifiques de l’antigène glucidique, qui peuvent présenter les peptides dérivés des porteurs aux lymphocytes T, provoquent le passage de la production d’anticorps de l’IgM à l’IgG1 via l’engagement CD154-CD40. amélioration potentielle de la mémorisation immunologique, de la maturation des anticorps et de la cytotoxicité à médiation cellulaire29, qui sont très importantes et utiles pour l’immunothérapie du cancer. Similaire aux résultats de l’analyse des anticorps totaux, nous avons observé des niveaux beaucoup plus élevés d’anticorps IgG1 dans les antisérums de 1c et 1d, ce qui prouve que ces deux glycoconjugués sont plus immunogènes que 1a et 1b et que le groupe N-acyl de l’antigène sTn un impact important sur les propriétés immunologiques.Figure 4 Titres de divers isotypes d’anticorps spécifiques de l’antigène dans le jour 37 antisérums obtenus avec glycoconjugués 1a − d (panels A ∢ D, respectivement), comme déterminé par ELISA. Chaque point représente le résultat ELISA d’une souris individuelle, et chacun .. allergie au lait de vache chez l’enfant. Nous avons également examiné la réactivité des antisérums obtenus avec 1a à sTn naturelle et à tous les dérivés synthétiques sTn discutés ci-dessus, y compris sTnNPhAc, sTnNMePhAc, sTnNMeOPhAc, sNnNAcPhAc et sTnNClPhAc par ELISA (Figure ​ (Figure5) .5). Dans ces expériences, les plaques ELISA ont d’abord été revêtues de sTn-HSA, sTnNPhAc-HSA, et de conjugués 2a et 222d respectivement, puis traitées avec les antiserums du jour 37. Il a été révélé que tous les antisérums n’avaient pratiquement pas de réactivité vis-à-vis de la sTn naturelle mais présentaient certains niveaux de réactivité vis-à-vis de sTnNPhAc et d’autres analogues de sTnNPhAc. Spécifiquement, l’antisérum de 1a (sTnNMePhAc) a présenté une très forte réactivité croisée avec sTnNPhAc et tous les autres dérivés, y compris sTnNMeOPhAc, sTnNAcPhAc et sTnNClPhAc. Essentiellement, l’antisérum de la a la même réactivité avec sTnNMePhAc et sTnNClPhAc. Les antisérums de 1b (sTnNMeOPhAc) et 1d (sTnNClPhAc) avaient une réactivité relativement faible à sTnNPhAc mais réagissaient fortement avec d’autres dérivés de sTnNPhAc. Le plus distinctement, l’antisérum de 1c (sTnNAcPhAc) n’a pas montré de réactivité évidente à sTnNPhAc ou à sTnNMePhAc, mais il a eu une réactivité croisée significative avec à la fois sTnNMeOPhAc et sTnNClPhAc. Comme les antisérums de 1a & spplus n’ont pas de réaction croisée avec sTn naturel, le groupe phénylacétyle de sTnNPhAc, sTnNMePhAc, sTnNMeOPhAc, sTnNAcPhAc et sTnNClPhAc doit avoir joué un rôle important dans l’augmentation de la spécificité de liaison à l’antigène et affinité. D’autre part, la grande réactivité croisée des antisérums de la sous-unité sTnNPhAc et d’autres analogues de sTn suggère qu’au moins une partie des anticorps provoqués par chaque glycoconjugué pourrait reconnaître et se lier à des analogues de sTn portant des groupes phénylacétyle différemment substitués. , qui peut s’expliquer par des interactions hydrophobes non spécifiques au lieu d’un effet stérique ou électronique. Néanmoins, ces résultats ont démontré que la majorité des anticorps induits par la souche étaient spécifiques des dérivés individuels de sTn. De plus, nous croyions que les réponses immunitaires spécifiques induites par les conjugués 1a étaient principalement contre l’antigène sTn entier au lieu du groupe phénylacétyle modificateur, parce que nos études précédentes ont montré que les anticorps induits par sTnNPhAc-KLH réagissaient à l’antigène hydrate de carbone entier au lieu du linker ou du groupe PhAc indépendant.23,24 Figure 5: Titres d’anticorps dans le jour 37 antisérums de 1a − d réactifs à sTnNPhAc-HSA (barres blanches), sTnNMePhAc-HSA (barres pointillées, 2a), sTnNMeOPhAc-HSA (barres hachurées, 2b), sTnNAcPhAc-HSA (barres barrées en diagonale, 2c), et sTnNClPhAc-HSA (barres grises, 2d), … En conclusion, nous avons synthétisé par une méthode convergente plusieurs dérivés N-phénylacétylés de l’antigène sTn, dont sTnNMePhAc, sTnNMeOPhAc, sTnNAcPhAc, et sTnNClPhAc ainsi que leurs conjugués KLH 1a − d. Les propriétés immunologiques des conjugués la ont été évaluées chez des souris C57BL / 6 et comparées à celles de sTnNPhAc. Il a été décrit que sTnNMePhAc, sTnNMeOPhAc, sTnNAcPhAc et sTnNClPhAc étaient plus immunogènes que sTnNPhAc et qu’ils induisaient presque exclusivement une réponse d’anticorps IgG1 à médiation par les cellules T, ce qui est utile pour l’immunothérapie du cancer. Parmi les quatre dérivés étudiés, les conjugués 1c et 1d provoquent des réponses immunitaires manifestement plus robustes que 1a et 1b. De plus, même si les antisérums de la ont montré une réactivité significative à sTnNPhAc et à tous les autres dérivés, ils n’avaient aucune réactivité vis-à-vis du sTn naturel. Par conséquent, les réponses immunitaires provoquées par la forme ont été spécifiques de la forme modifiée totale de l’antigène sTn non seulement aux groupes N-acyle non naturels. En mettant tous ensemble, nous identifions sTnNClPhAc comme le candidat le plus prometteur pour le développement de vaccins contre le cancer pour notre nouvelle stratégie immunothérapeutique contre le cancer. Premièrement, le conjugué KLH de sTnNClPhAc s’est avéré être le plus immunogène pour induire des titres élevés d’anticorps IgG1, et deuxièmement, parmi les quatre dérivés, sTnNClPhAc contient le plus petit substituant; ainsi, son précurseur peut être plus facilement accepté par les mécanismes de biosynthèse de sTn et d’autres sialo-TACA. À cet égard, nous étudions actuellement l’efficacité de la Np-chlorophénylacétyl mannosamine et de l’acide Np-chlorophénylacétyl sialique pour métaboliser métaboliquement les cellules cancéreuses.