Haute fréquence de la résistance à la rifampine identifiée dans un clone épidémique de Clostridium difficile d’un grand hôpital universitaire

Haute fréquence de la résistance à la rifampine identifiée dans un clone épidémique de Clostridium difficile d’un grand hôpital universitaire

Contexte La rifampine est utilisée comme traitement d’appoint de la maladie associée à Clostridium difficile, et son dérivé, la rifaximine, est devenu un antimicrobien attrayant pour le traitement de la maladie associée au C difficile. La résistance à la rifampicine chez les souches de C difficile est peu courante. Prévalence de la résistance à la rifampicine parmi les isolats de C difficile pendant et en dehors d’un grand hôpital universitaire La sensibilité à la rifampicine a été testée à l’aide du test E Le clone épidémique BI / NAP C difficile a été identifié par génotypage tcdC et nombre variable de répétitions en tandem. Le fragment de paire de base du gène rpoB a été séquencé pour les isolats. Des données sur l’exposition à la rifamycine ont été obtenues pour tous les patients. Résultats La résistance à la rifampicine a été observée en% des isolats récupérés et% des isolats de clones épidémiques P & lt; Six génotypes de rpoB étaient associés à la résistance à la rifampicine Des patients exposés à des rifamycines présentaient un C difficile résistant à la rifampicine, comparativement à un risque relatif de patients non exposés; % d’intervalle de confiance, -Conclusions La résistance à la rifampicine est fréquente chez les clones épidermiques de C difficile dans notre établissement L’exposition aux rifamycines avant le développement de la maladie associée au C difficile était un facteur de risque d’infection par le C difficile. L’utilisation de rifaximine peut être limitée. traitement de la maladie associée au C difficile dans notre établissement

Clostridium difficile est responsable de maladies d’origine hospitalière allant de la diarrhée légère à la colite pseudomembraneuse sévère. Une épidémie de maladie sévère associée au C difficile a commencé au centre médical de l’Université de Pittsburgh – Hôpital presbytérien UPMC; Pittsburgh, PA pendant – Au cours de la dernière décennie, un nombre croissant de cas de CDAD épidémique a été noté Ce changement dans l’épidémiologie CDAD correspondait à l’émergence d’un clone du C difficile qui était rarement rencontré auparavant. clone est désigné BI / NAP sur la base de l’analyse des enzymes de restriction et du profil PFGE Augmentation de la mortalité et de la morbidité, faible performance clinique des antimicrobiens traditionnellement utilisés pour les MACD et des taux élevés de rechute associés au clone épidémique BI / NAP. Le besoin de nouvelles thérapies CDAD Les Rifamines sont actuellement envisagées pour le traitement de la DACD sur la base des données de sensibilité in vitro. Hecht et al ont rapporté une résistance à la rifampicine en% des isolats cliniques provenant des États-Unis. CDAD en raison de son manque d’absorption systémique Les niveaux élevés de rifaximin qui peuvent être atteints dans l’intestin sont un pharmacol idéal Profil ogique pour le traitement de la DACD Les taux de résistance spontanée à la rifaximine basée sur la dilution en gélose ont été rapportés> à des concentrations de médicament qui sont multipliées par le CMI de la rifaximine pour le C difficile. une rechute a été rapportée Cependant, O’Connor et al ont rapporté que la résistance à la rifaximine dans les isolats de C difficile est associée à des mutations ponctuelles dans rpoB, le gène codant pour la sous-unité bêta de l’ARN polymérase de C difficile; Dans cette étude, nous avons déterminé la prévalence et les mécanismes moléculaires de la résistance à la rifampicine chez des isolats de C difficile prélevés sur des échantillons prélevés chez des patients atteints de DACAD hospitalisés à l’UPMC. Nous avons également examiné l’association entre la résistance à la rifampicine et la rifampicine. la résistance à la rifampicine avec l’exposition à la rifampicine et le clone BI / NAP pour comprendre l’origine potentielle du C difficile à la rifampicine dans notre institution

Patients et méthodes

Au cours de chaque période, seul le résultat du premier test de toxine pour chaque patient a été pris en compte, pour exclure la plupart des cas de rechute CDAD acquise à l’UPMC ou attribuable à l’UPMC a été définie en utilisant un épidémiologique élargi. Les dossiers de pharmacies électroniques de l’UPMC ont été examinés pour tous les patients de la cohorte afin de déterminer l’incidence de l’exposition à la rifampicine rifampicine, rifapentine, rifabutine et rifaximine au cours des mois précédant la date d’apparition de la DACD. Pour tous les tests de laboratoire utilisés dans cette étude, le personnel de laboratoire de recherche a été aveuglé à l’identité du patient Les tests de toxicité des selles de C difficile ont été effectués par un test de cytotoxicité Hybrides de diagnostic Tous les échantillons de selles envoyés pour tests de toxines ont également été cultivés pour C difficile sur c comme décrit ailleurs Des isolats présomptifs de C difficile ont été identifiés par coloration de Gram et la morphologie des colonies et des odeurs, ont été repiqués sur gélose au sang de mouton CDC anaérobie préréduite Becton Dickinson, et ont été identifiés biochimiquement avec un RapID ANA. On a confirmé que les surnageants de cultures de bouillon de viande hachés de tous les isolats de C difficile étaient toxinogènes par un test de cytotoxicité Test de sensibilité à la rifampicine de C. difficileIlsolates ont été cultivés à partir de stocks de tryptone,% d’extrait de levure et d’arginine% d’agar contenant du taurocholate de sodium On a préparé des suspensions d’isolats de C difficile avec un% de transmittance minimum à nm dans du milieu de thioglycolate préréduit sans dextrose ou indicateur Becton Dickinson. Cette suspension a été appliquée à des plaques de gélose Brucella préréduites. coton-tige avec la suspension dans les directions Rif Des bandelettes E-test d’ABPIN Biodisk ont ​​été placées sur chaque plaque selon les instructions du fabricant. Les plaques ont été scellées et incubées anaérobiquement dans AnaBags Hardy Diagnostics à ° C pendant h Les E-tests ont été lus selon les instructions du fabricant La susceptibilité à la rifampicine a été classée selon les MICs ⩽ μg / mL, – μg / mL et & gt; μg / mL Bien que la rifampine ne définisse pas de points de rupture pour le C difficile, ces catégories sont utilisées pour désigner les isolats sensibles à la rifampicine, à la rifampicine et à la rifampicine, respectivement. les souches de référence du génome CD ont été utilisées comme témoins pour l’analyse de susceptibilité à la rifampicine C difficile Les isolements C difficilegenotypingC difficile appartenant au clone BI / NAP ont été identifiés par MLVA et par génotypage tcdC, comme décrit ailleurs Isolates Les isolats portant d’autres génotypes tcdC ont été classés comme non-BI / NAP. Analyse de la séquence d’un sous-ensemble d’isolats a été sélectionné pour l’analyse de la séquence rpoB, y compris la rifampicine, la rifampicine Des isolats intermédiaires résistants à la rifampicine Des isolats sensibles à la rifampicine ont été La région de paire MLVAA du gène rpoB, connue pour contenir des mutations ponctuelles associées à une résistance élevée à la rifampicine et à la rifaximine dans le C difficile, a été ciblée pour l’amplification par PCR et l’analyse de séquence En bref, l’ADN génomique PCR amplifiée avec les amorces CDrpoB-F ‘-ATG-GAAGCTATAACGCCT-CAA-‘ et CDrpoB-R ‘-ACA-GCACCATTTACAGTT-CTA-‘ dans un mélange réactionnel contenant AmpliTaq × tampon PCR, nmol de chlorure de magnésium, pmol chacun de CDrpoB-F et les amorces CDrpoB-R, nmol de chaque désoxynucléotide triphosphate, et U de AmpliTaq Gold Applied Biosystems Les conditions de cyclage étaient une incubation initiale à ° C pendant min, suivie de cycles consistant en min à ° C, min à ° C, et min à ° C. C Les produits de PCR résultants ont été purifiés par précipitation au polyéthylèneglycol et ont été séquencés avec les amorces CDrpoB-F et CDrpoB-R en utilisant le kit de terminaison BigDye, version Applied Biosystems Capillary s Le fragment rpoB de chaque isolat a été séquencé à partir des deux brins d’ADN provenant de réactions de PCR indépendantes, et les séquences qui différaient du gène de référence CD ont été traduites pour identifier les substitutions d’acides aminés dans RpoB avec l’utilisation du Sequencher. progiciel, version Gene Codes La souche de référence CD a également subi un séquençage rpoB comme contrôle interne, et les séquences conformes à la séquence CD rpoB ont été considérées comme des méthodes sauvagesProcessus statistiqueFisher a été utilisé pour tester l’association entre les variables catégorielles SAS, version SAS Institute, a été utilisé pour toutes les analyses

Résultats

Sous-typage moléculaire Parmi les patients qui répondaient aux critères d’inclusion de l’étude,% présentaient des isolats toxigènes de C difficile récupérés dans leurs échantillons; Des isolats% ont été récupérés pendant – et des isolats% ont été récupérés pendant deux cent cinq% des isolats ont été identifiés comme BI / NAP par MLVA et tcdC génotypageRifampicine susceptibilité des C. difficileisolates de l’UPMC, – et des isolats testés pour la sensibilité à la rifampicine , ⩽ μg / mL,% étaient des MIC résistantes, & gt; μg / mL, et% ont montré une CMI intermédiaire, – μg / mL de susceptibilité à la rifampicine; les isolats intermédiaires présentaient des CMI de rifampine de – μg / mL La proportion d’isolats de C difficile résistants à la rifampicine a diminué pendant la période d’étude de% de la résistance à la rifampicine dans le clone épidémique BI / NAP des isolats BI / NAP. identifiés par MLVA et génotypage tcdC,% étaient résistants à la rifampicine, alors que seulement% des isolats non BI / NAP étaient résistants à la rifampicine P & lt; Les isolats intermédiaires de la rifampicine étaient peu fréquents n = et ne présentaient aucune association avec le clone BI / NAP La proportion d’isolats BI / NAP résistants à la rifampicine a diminué au cours de la période d’étude de% du – à% de P & lt;

Diapositives de microscopie de Rifampin dans des isolats de Clostridium difficile de l’Université de Pittsburgh Medical Center-Presbyterian Hospital, – et Table ViewTéléchargement de diapositives Rifampin dans des isolats de Clostridium difficile de l’Université de Pittsburgh Medical Center-Presbyterian Hospital, – et RpoB polymorphismes d’acides aminés associés à la résistance à la rifampicine Il y avait différents polymorphismes de RpoB identifiés dans le sous-ensemble étudié d’isolats de C difficile de rifampicine-intermédiaire et -résistant Toutes les substitutions d’acides aminés identifiées résidaient entre l’acide aminé et de RpoB La majorité de ces substitutions d’acides aminés ont été rapportées précédemment la substitution de HN seule et la combinaison de substitutions d’acides aminés ST / RK sont toutes deux nouvelles Tous les isolats résistants à la rifampine contenaient la substitution RK, qui était la substitution unique la plus fréquente [%] d’isolats résistants à la rifampine testés parmi les isolats résistants à la rifampine testé Les isolats intermédiaires de rifampicine ne contenaient que le tableau de substitution HN Des isolats BI / NAP résistants à la rifampicine qui ont subi l’analyse de la séquence rpoB,% contenaient la substitution RK seule et les isolats BI / NAP résistants à la rifampine contenaient des substitutions supplémentaires d’acides aminés. -BI / NAP isolat résistant à la rifampicine qui a été examiné pour les mutations RpoB avait seulement la substitution d’acide aminé RK Cinq isolats BI / NAP sensibles à la rifampicine et des isolats non BI / NAP sensibles à la rifampine qui ont été examinés pour les mutations RpoB contenaient RpoB de type sauvage

Diapositive de vue grandTéléchargement de diapositives Substitutions d’acides aminés dans RpoB associées à la résistance à la rifampicine de Clostridium difficileTable View largeTéléchargement de diapositives Substitutions d’acides aminés dans RpoB associées à la résistance à la rifampicine de Clostridium difficile Exposition à la rifampicine et au développement subséquent de la rifampicineC difficile Parmi les patients répondant aux critères de l’étude des résultats indiquant des expositions à la rifamycine au cours des mois précédant leur premier résultat positif au test de toxicité des selles dans le tableau des périodes d’étude. Des isolats étaient disponibles pour% de ces patients et un isolat a été obtenu lors d’une rechute CDAD du patient restant. les patients exposés à la rifamycine ont reçu cette classe d’antimicrobiens pour un patient présentant une DACAD, et ceci pour un épisode CDAD sévère primaire pour lequel aucun isolat n’a été retrouvé. La rifampicine a été prescrite pour des patients% et a été administrée pour des doses quotidiennes définies avant récupération de C diffi Un patient a reçu des doses journalières définies de rifabutine pendant plusieurs jours avant le rétablissement du C difficile. Le patient a reçu la rifabutine et la rifampine séquentiellement pour des doses quotidiennes définies avant le développement de la DACD, mais aucun isolat n’a été récupéré. concomitante au développement du C difficile résistant à la rifampicine Cependant, dans les cas, la dernière exposition à la rifampicine enregistrée était – jours avant la récupération du C difficile à partir du tableau des échantillons de selles Un isolat trouvé dans un échantillon obtenu du patient était sensible à la rifampicine

Tableau View largeTélécharger la diapositive Rifamycin classe exposition chez les patients atteints de CDAD CDD à l’Université de Pittsburgh Medical Center-Presbyterian Hospital, – et Table View largeDownload slideRifamycin classe exposition chez les patients atteints de CDAD à l’Université de Pittsburgh Medical Center-Presbytérien Parmi ces patients,% présentaient une infection due au C difficile résistant à la rifampicine, tandis que% des patients exposés à la rifamycine présentaient une infection due à Les patients atteints de CDAD résistants à la rifampicine ont été plus de deux fois plus susceptibles que les autres de développer une infection en raison du risque relatif de C difficile lié à la rifampicine; % CI, –

Discussion

Cette étude démontre que plus d’un tiers des isolats de C difficile récupérés dans notre établissement au cours de la période étudiée étaient résistants à la rifampicine. Cette découverte est importante car, à notre connaissance, une telle fréquence de résistance à la rifampicine pas encore rapporté Bien que l’exposition à la rifampicine ait été associée à un risque accru de développement ultérieur du C difficile résistant à la rifampicine, seuls les patients atteints de CDAD dans notre étude avaient été exposés à la rifampine, et l’exposition à la rifampine était accidentelle. était destiné à d’autres infections que la DACD. La proportion d’isolats primaires de C difficile résistants à la rifampicine et à la rifampicine qui peuvent être directement attribués à l’exposition antérieure à la rifampicine dans cette étude était de%. Ces données suggèrent que, bien que la rifamycine d’isolats résistants, transmission de C difficile résistant à la rifampicine à des patients sans antécédents L’utilisation de la famycine est beaucoup plus fréquente à l’UPMC Cette observation est étayée par la découverte que la plupart des isolats de C difficile résistants à la rifampicine appartenaient au clone BI / NAP. Nos observations s’appuient sur des résultats similaires récemment rapportés par O’Connor et al. Le gène rpoB d’un sous-groupe d’isolats de cohorte C difficile n’a révélé aucun polymorphisme RpoB associé à la résistance à la rifampicine, bien que tous les isolats résistants à la rifampine testés dans cette étude partageaient la substitution RK suffisante pour conférer une résistance élevée à la rifampicine. , μg / mL par dilution en agar Les taux de rifaximine dans l’intestin peuvent atteindre des niveaux de mg / mL , mais il est peu probable que ce mécanisme de résistance à la rifampine puisse être surmonté par des concentrations accrues. en plus de RK, que O’Connor et al ont montré être trouvés dans des isolats viables aux concentrations les plus élevées de rifampicine utilisées dans la méthode de dilution sur gélose MIC, & gt; L’observation de multiples polymorphismes RpoB dans des isolats BI / NAP suggère que des mutations ponctuelles secondaires dans rpoB sont survenues pendant la circulation de la souche épidémique dans notre institution. Des isolats avec plusieurs substitutions d’acides aminés RpoB peuvent représenter des souches uniques de circulation BI / NAP, certaines Parmi ceux-ci, la résistance à la rifampicine et le clone épidémique ont montré que les isolats de BI / NAP étaient sensibles à la rifampicine. Ceci pourrait refléter la réversion du clone épidémique vers un rpoB de type sauvage en l’absence relative de rifampicine. Les isolats de clones épidermiques rpoB peuvent présenter un désavantage concurrentiel par rapport aux isolats de type sauvage, comme l’ont montré Maughan et al pour l’efficacité de la sporulation chez Bacillus cereus. diminution de l’exposition à la rifamycine au cours de notre deuxième période d’étude et l’augmentation de L’association entre la résistance à la rifampicine et le clone BI / NAP peut être spécifique à notre institution et ne peut que refléter l’expansion clonale. Des études supplémentaires seront nécessaires pour évaluer la résistance à la rifampicine. déterminer la prévalence de la résistance à la rifampicine dans le C difficile dans d’autres établissements et déterminer si le clone BI / NAP épidémique et / ou d’autres souches de C difficile sont associés à la résistance à la rifampicine Le nombre d’individus exposés à la rifampine pourrait avoir été sous-estimé , parce que les dossiers de pharmacies électroniques n’incluent pas les expositions externes aux rifamycines, bien que ces expositions soient probablement rares, étant donné la rareté des indications de rifamycine pour les patients externes dans le sud-ouest de la Pennsylvanie. de notre concentration sur les isolats de patients atteints de DACD primaire, En résumé, la présente étude démontre la résistance généralisée à la rifampicine primaire chez des isolats de C difficile provenant d’une cohorte de patients atteints de CDAD. Analyse des séquences des substitutions d’acides aminés identifiées par le gène rpoB associées à la rifampicine Résistance Ces mutations sont associées à des CMI de rifaximine qui ne sont probablement pas surmontées même après l’administration de rifaximine Bien que cette étude soulève des questions sur l’utilisation de la rifaximine pour le traitement de la MACD dans notre établissement, la rifaximine peut être utile comme traitement adjuvant pour les patients en rechute CDAD Des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer la prévalence du C difficile à la rifampicine dans d’autres institutions et pour caractériser l’effet des mutations de rpoB sur la forme physique du C difficile, la sporulation, la germination et la production de toxines

Remerciements

Nous remercions Ashley Conley pour son aide avec les tests de résistance au Clostridium difficile. Soutien financier aux instituts de santé de l’Institut national de recherche sur les allergies et les maladies infectieuses KAI à LHHPotentiel de conflits d’intérêtsLHH et JWM ont reçu des subventions de recherche de la part de ViroPharma CAM servi au bureau des conférenciers de l’Institut Robert Michael Educational AWP a reçu des honoraires de consultant de Valley Health Systems Tous les autres auteurs: no conflicts