Criblage bioanalytique des antagonistes de la riboflavine pour Targeted Drug Delivery — Une étude thermodynamique et cinétique

Criblage bioanalytique des antagonistes de la riboflavine pour Targeted Drug Delivery — Une étude thermodynamique et cinétique

riboflavine hydrosoluble (RF, Figure ​ Figure 1) 1) est une vitamine essentielle (B2) nécessaire à la biosynthèse des cofacteurs redox à base de flavine, tels que la flavine mononucléotide (FMN) et flavine adénine dinucléotide (FAD). La disponibilité cellulaire de cette vitamine pour la biosynthèse du cofacteur est médiée par les récepteurs RF qui facilitent l’absorption des molécules RF avec une efficacité élevée.1 Les récepteurs RF, également appelés porteurs RF, sont exprimés sous la forme d’isoformes solubles et liées à la membrane.1 Nous avons récemment commencé à explorer RF comme un ligand pour cibler le traitement du cancer pour un certain nombre de raisons. Premièrement, les récepteurs RF sont surexprimés dans certaines lignées cellulaires humaines provenant de cancers du sein et de la prostate, ce qui fait de cette famille de protéines un type de biomarqueur de tumeur.2,3 Deuxièmement, des études récentes démontrent que ces récepteurs membranaires médient l’absorption cellulaire Sur la base de ces études, nous avons démontré avec succès l’administration de médicaments ciblés par RF sur des cellules cancéreuses in vitro dans le cadre d’un récepteur à médiation cellulaire.7 Dans cette étude, le dendrimère conjugué aux RF Les nanoparticules ont administré le méthotrexate, un médicament anticancéreux (MTX), pour tuer les cellules KB par internalisation médiée par le récepteur. Ce travail a suggéré une voie générale pour la livraison sélective de molécules de médicaments anticancéreux aux cellules cancéreuses qui surexpriment les récepteurs RF.Figure 1Structures de RF, RF-linker (1), et de petites molécules à base hétérocyclique évaluées pour leur activité potentielle comme ligands pour Récepteur RF. La présente étude rapporte l’identification et la caractérisation de nouveaux antagonistes RF à double action qui devraient avoir un impact immédiat sur le ciblage du cancer par les récepteurs RF. Par définition, les antagonistes RF se réfèrent à une classe de petites molécules structurellement apparentées aux RF et qui interfèrent avec l’activité cellulaire des RF en se liant de manière compétitive aux récepteurs RF ou aux enzymes dont les activités sont associées aux cofacteurs flavine.8,9 Nous avons cherché à identifier antagonistes de la RF en raison de leurs avantages potentiels pour la livraison ciblée dans le cancer. Ces antagonistes RF devraient être capables de se lier au récepteur RF pour médier l’absorption via l’internalisation du complexe formé avec un récepteur RF. Cependant, contrairement à la FR native qui a des effets trophiques positifs sur le cancer, ces molécules peuvent tuer les cellules cancéreuses en interférant avec les fonctions cellulaires des cofacteurs de flavine tels que la FMN et le FAD, essentiels pour la maintenance cellulaire9,10. Dans le but de développer des antagonistes RF pour des applications de délivrance de médicaments ciblées, nous avons essayé d’identifier de nouveaux antagonistes RF susceptibles de modifications chimiques pour permettre la conjugaison à des nanoparticules et ont le potentiel d’induire une cytotoxicité. . Pour identifier ces antagonistes RF potentiels, nous avons cherché dans la base de données SciFinder Scholar en se concentrant sur les molécules de petits médicaments dont les structures centrales imitent la tête isoalloxazine de RF. La raison de cette recherche est que l’hétérocycle isoalloxazine apporte une contribution clé pour la liaison du récepteur en empilant entre les deux plans hydrophobes qui comprennent une fente réceptrice pour la protéine de liaison RF des mammifères (RfBP) .11 Notre recherche structurale a conduit à un petit ensemble de composés composé de lumiflavine, de perphénazine, de chlorpromazine, de quinacrine et de chloroquine (figure ​ (figure1) .1). Parmi ceux-ci, la quinacrine et la chlorpromazine ont déjà été étudiées par dichroïsme circulaire (CD) et spectroscopie de fluorescence pour la liaison au récepteur, mais aucune preuve n’a été trouvée pour la liaison stéréospécifique de quinacrine et de chlorpromazine, alors que cette étude n’excluait pas la formation de complexes. RfBP.12 Chacune des molécules sélectionnées contient un hétérocycle plat impliquant un accepteur de liaison H au milieu de l’hétérocycle fusionné, comme la pyridine (N) ou la thiazine (S) au lieu de la pyrazine (N) pour RF. Cette étude examine ces molécules pour déterminer leur activité de liaison au RfBP en utilisant deux méthodes bien établies impliquant la calorimétrie de titration isotherme (ITC) et la résonance plasmonique de surface (SPR). Les expériences de liaison sont effectuées avec RfBP de poulet, un récepteur RF hautement validé affichant le niveau significatif d’homologie interspécifique dans la structure et la fonction, 1,8,11 et ses résultats sont présentés ici avec les caractéristiques thermodynamiques et cinétiques de l’interaction de chacun de ces petites molécules avec RfBP.ITC ont d’abord été utilisées pour déterminer la constante de dissociation et la stoechiométrie de liaison pour l’interaction entre RF et RfBP à pH 4, 7,4 et 9.La figure 22 montre les thermogrammes ITC et la zone intégrée correspondante des pics de liaison RF et quinacrine à RfBP dans du PBS (phosphate de sodium 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH 7,4). Les données de la figure 2b, d2b, d ont été ajustées à un modèle indépendant, et les paramètres d’ajustement du modèle (H), KA et n (stœchiométrie de liaison) sont présentés dans le tableau 1, tout comme les estimations calculées pour Δ G et Δ S. Les constantes de liaison nanomolaires obtenues pour une gamme de pH couvrant cinq ordres de grandeur suggère une liaison étroite entre RF et RfBP. La liaison est optimale au pH physiologique. Cependant, l’affinité est significativement plus faible à pH 4, une observation favorable au mécanisme de la dissociation RF médiée par le pH dans les endosomes (pH ∼ 5) .6,8 Le grand Δ Η et les plus petites valeurs de Δ S indiquent que l’interaction de liaison est en grande partie entraînée par l’enthalpie. La constante de dissociation apparente, KD de 6,6 nM dans du phosphate 0,1 M d’ITC, est en excellent accord avec deux études précédentes impliquant une extinction de fluorescence, où un KD de 2 nM a été obtenu dans un tampon phosphate 0,1 M13 et un KD de 1,3 nM a été obtenu dans Tampon phosphate 0,01 M pour l’interaction de liaison RfBP RF8Figure 2 Données ITC pour l’interaction entre (a) RF (40 μ M) et (c) quinacrine (40 μ M) avec le poulet RfBP (4 μ M) à 25 ° C dans du tampon PBS. Tracé de la zone intégrée sous chaque pic d’injection pour RF (b) et quinacrine (d). Le solide … Tableau 1 Paramètres thermodynamiques montrant la dépendance du pH du système RF à 25 ° CThe la liaison des cinq antagonistes RF potentiels à RfBP a été examinée par ITC. Une isotherme de liaison représentative est montrée pour la quinacrine avec RfBP sur la figure 2c, d, 2c, d, et les paramètres thermodynamiques de la liaison des antagonistes RF sont présentés dans le tableau 2. Sur la base de KD, l’ordre de la force de liaison pour les antagonistes RF et RF à RfBP est RF > lumiflavine > quinacrine > la chloroquine. L’ordre des affinités de liaison est déterminé principalement par l’amplitude des changements enthalpiques (exothermique), mais il est également influencé par le terme entropique, en particulier pour les molécules où la contribution enthalpique est similaire (par exemple, lumiflavine vs quinacrine). Le tableau 2 montre également que les valeurs de G Δ H et & g; G sont plus proches en amplitude pour les analogues RF, suggérant qu’ils ne répliquent pas complètement les contacts intermoléculaires entre RF et RfBP. Les différences dans l’entropie de liaison sont probablement dues à des changements de conformation de la protéine lors de la liaison à RF, qui ne se produisent pas pour les analogues RF. D’autres composés testés, la perphénazine et la chlorpromazine, n’ont montré aucune affinité de liaison vis-à-vis du RfBP. Bien que les composés aient été sélectionnés par des similitudes structurelles basées sur l’hétérocycle tricyclique, la perphénazine et la chlorpromazine sont les deux seules molécules où un atome de soufre (S) a remplacé le N à la position N (5) dans le cycle isoalloxazine. Les études ITC indiquent que les modifications de la position N (5) inhibent la liaison des antagonistes RF au RfBP. Comme la position N (5) est impliquée dans les réactions redox, il est possible que les changements à cette position affectent la liaison à RfBP.1,11 En outre, la capacité de N à servir d’accepteur de liaison H peut être critique pour le resserrement. liaison, tandis que le remplacement par S peut éliminer une telle capacité. La lumiflavine, la quinacrine et la chloroquine montrent des variations de KD de l’ordre de 1 − La différence structurale majeure entre ces trois antagonistes RF est le substituant à la position N (10). Il est clair que le remplacement par une chaîne latérale non gribotique a pour effet d’augmenter les valeurs de KD de 1 et de 2 ordres de grandeur par rapport à RF. De plus, une réduction de l’affinité de liaison est obtenue en remplaçant le cycle alloxazine sur la tête hétérocycle de RF. Ainsi, en criblant plusieurs molécules mimant les RF avec une polarité et des similarités structurales avec RF, nous avons démontré que l’affinité de liaison des antagonistes RF envers RfBP est ajustable. Bien qu’une étude antérieure basée sur la spectroscopie CD ait conduit à un résultat non concluant pour la quinacrine et la chlorpromazine12, notre étude montre une large applicabilité et sensibilité de la méthode ITC pour les études impliquant des interactions ligand / récepteur RF14. Cette méthode nous permet de démontrer clairement liaison de la quinacrine à RfBP à la concentration submicromolaire et de confirmer l’absence de preuve trouvée pour la liaison du récepteur avec la chlorpromazine.Tableau 2 Paramètres thermodynamiques de RF et RF Antagonistes de liaison avec RfBP dans PBS (pH 7,4) à 25 ° des études ITC, nous avons choisi la quinacrine avec un KD de 0,26 μ M pour une étude ultérieure par spectroscopie SPR. La présente étude SPR pour les interactions ligand de RfBP est basée sur une approche qui utilise la présentation d’un ligand RF à la surface d’une puce de capteur SPR préparée par immobilisation de RF-linker 1 (Schéma S1 dans les informations de support).15 La liaison de RfBP à la puce du capteur présentateur RF a été étudiée en faisant varier les concentrations de la protéine dans la gamme de 33,0 à 3,70 μ M (figure ​ (figure 3) .3). RfBP lié à la surface d’une manière dose-dépendante caractérisée par l’association de type biphasique, sensiblement à des doses plus élevées. De telles caractéristiques de liaison peuvent refléter différents niveaux d’accessibilité à la surface de dextrane hydratée présentant des ligands RF ou des changements conformationnels de la protéine lors de l’occupation du ligand. Les résultats de liaison suggèrent également une dissociation lente de la protéine, une caractéristique rapportée précédemment15. En tant que témoin, la sérumalbumine bovine ne s’est pas liée de manière spécifique à la surface présentant la FR (figure S3 dans les informations de support). La quantité de RfBP liée à la surface a été analysée par le graphique de Scatchard en fonction des concentrations de RfBP dans le tampon (encadré sur la Figure 3). L’analyse a donné une valeur pour la constante de dissociation à l’équilibre KD (3,55 × 10 − 5 M). La constante de dissociation pour RfBP a également été calculée par une méthode d’analyse différente, où nous avons calculé les paramètres de liaison cinétique (off rate = koff, on rate = kon) en analysant chaque sensorgramme selon le logiciel BIAevaluation. Étant donné la stoechiométrie 1: 1 pour l’interaction ligand récepteur 8,15, nous avons utilisé le modèle de Langmuir16 pour l’ajustement de la courbe globale (lignes pointillées sur la figure 3) et en avons déduit les paramètres cinétiques (kon = 1,03 × 102 M − 1 s − 1; koff = 1,49 × 10 − 3 s − 1; χ 2 = 2,5). La constante de dissociation d’équilibre résultante KD a été déterminée comme étant de 1,45 (± 0,49) × 10 − 5 M. Cette valeur de KD obtenue à partir de l’analyse cinétique est proche de la valeur (KD = 3,55 × 10 𢈒 5 M) déterminée à partir de l’analyse de Scatchard pour la liaison de RfBP.Figure 3Binding of RfBP to the ligand 1 immobilisé sur une surface de puce de capteur CM5. La concentration de RfBP dans le tampon HBS-EP (pH 7,4) est indiquée sur chacun des sensorgrammes. Les sensorgrammes SPR ont été corrigés pour l’effet en vrac (Figure S1 dans le Supporting … La méthode SPR développée ici a ensuite été utilisée pour cribler des petites molécules RF imitant l’adsorption de RfBP à la surface de la puce présentant le ligand RF 1. A titre d’illustration La Figure 44 montre que l’addition du ligand RF soluble 1 à la solution contenant le RfBP a inhibé la liaison de RfBP (11.1 μ M) à la surface. concentrations de 1 en solution d’une manière dose-dépendante où environ 90% de l’adsorption de la protéine a été inhibée aux concentrations supérieures à ∼ 500 μ M. Les résultats des expériences de compétition suggèrent que l’interaction entre RfBP et 1 immobilisé à la surface est biospécifique et peut être bloqué de manière compétitive en ajoutant 1 libre dans la solution.L’expérience de compétition de ligand a également été réalisée avec RF et quinacrine, l’identification de petite molécule RF-mimant d comme ligand pour RfBP de l’étude ITC (figure ​ (figure 44 et figure S2 dans les informations de support). Chacune des expériences suggère un blocage spécifique de l’adsorption de RfBP à la surface en fonction de la concentration du ligand. Sur la base des résultats SPR, la constante d’inhibition Ki a été dérivée pour chaque ligand selon l’équation de compétition de la solution, 17 et ses valeurs sont résumées dans le tableau S2 de l’information de support. Comme molécule de référence, RF a une valeur Ki de 0,35 μ M, une activité inhibitrice environ 7 fois plus puissante que son dérivé N (3) 1. De plus, les expériences SPR ont démontré que la quinacrine est un inhibiteur compétitif pour RfBP avec une valeur Ki de 6,7 μ M. Ainsi, la quinacrine a une activité inhibitrice pour RfBP & gt; 19 fois plus faible que RF. Figure 4 (a) Représentation sensorielle des SPR des expériences de liaison compétitive avec 1. La liaison de RfBP (11.1 μ M) à la La surface de puce RF (1) immobilisée a été inhibée de manière compétitive par l’addition du ligand soluble 1 à la solution de RfBP. … En résumé, les résultats du SPR sont en bon accord avec les résultats de l’étude de l’ITC. Il confirme également que la quinacrine et la chloroquine sont des membres nouvellement identifiés des ligands compétitifs mimant RF. En tant que médicaments traditionnellement utilisés dans le traitement du paludisme18 et de la polyarthrite rhumatoïde19, ces molécules présentent diverses activités biologiques en raison de leur capacité à inhiber un certain nombre de cibles biologiques importantes telles que l’ADN topoisomérase II18,20 et les enzymes métaboliques.21 Récemment, la quinacrine Cette activité est attribuée à sa capacité à interférer avec les voies de signalisation cellulaire telles que l’activation de la voie p5325 et l’inhibition de Bcl-xL, une protéine anti-apoptotique.23 La présente étude suggère une autre nouvelle application de la classe quinacrine des molécules médicamenteuses en tant que ligands pouvant cibler le RfBP, un récepteur d’absorption de la vitamine B2, d’une manière compétitive par rapport aux RF. Les implications de cette découverte sont nombreuses. Premièrement, la présente étude suggère une nouvelle perspective supplémentaire pour les activités biologiques associées à la quinacrine et à ses analogues. Sur la base de l’interprétation de nos données, il est également concevable que la quinacrine puisse interférer avec l’absorption RF médiée par le récepteur à l’extérieur de la cellule et / ou bloquer une large gamme d’activités enzymatiques médiées par le cofacteur flavine après internalisation. Deuxièmement, malgré une affinité modérée pour le récepteur RF à la concentration micromolaire inférieure, la quinacrine peut servir de ligand de ciblage pour l’administration spécifique de molécules thérapeutiques supplémentaires ou d’agents d’imagerie aux cellules cancéreuses surexprimant le récepteur impliquées dans les cancers du sein et de la prostate. Pertinent à cet utilitaire de ciblage, il serait possible d’appliquer le concept de conception de ligand multivalent, 7,16,26 dans lequel même la capacité de ciblage sous-optimal peut être améliorée par une liaison étroite multivalente.