Immunodosage enzymatique pour le diagnostic de la maladie des griffes du chat définie par la réaction en chaîne de la polymérase

Immunodosage enzymatique pour le diagnostic de la maladie des griffes du chat définie par la réaction en chaîne de la polymérase

Immunofluorescence des cellules entières Les tests IFA pour la détection des immunoglobulines anti-Bartonella henselae IgG sont couramment utilisés pour diagnostiquer la maladie des griffes du chat CSD La nécessité de cultiver B henselae dans les cellules Vero pour la préparation des antigènes et l’absence de tests d’immunofluorescence Les principaux inconvénients de cette forme de test Nous décrivons les résultats d’un dosage immuno-enzymatique EIA pour IgM et IgG utilisant des antigènes membranaires externes insolubles à la N-lauroyl-sarcosine issus de B henselae cultivés en gélose chez des patients présentant une lymphadénite régionale définie par CSD, contact chat et ≥ test de confirmation: réaction en chaîne par polymérase, test cutané ou culture de B henselae Bien que cette méthode ait été utilisée comme outil de diagnostic dans plusieurs rapports de cas, elle n’a pas été évaluée auparavant dans une vaste étude de cas de CSD définitivement prouvés suivre ce site. étude indiquent que l’EIA décrite ici peut jouer un rôle important dans le sérodiagnostic des CSD, bien que l’amélioration de la sensibilité , en particulier celle de l’IgM, serait souhaitable

Environ 100% des patients atteints de CSD développent des manifestations atypiques, y compris le syndrome oculoglandulaire de Parinaud, la neurorétinite, l’encéphalite, l’érythème noueux, l’arthrite et les nodules pulmonaires. Un diagnostic rapide et précis de la DSC est important car la présentation clinique et l’évolution de la DSC, habituellement une lymphadénite bénigne et auto-limitée mais prolongée, peuvent ressembler à un lymphome ou à d’autres processus malins Pour exclure ces derniers diagnostics, les patients subir des procédures diagnostiques complètes, coûteuses et parfois invasives Le diagnostic en laboratoire est particulièrement important dans les cas de CSD atypiques avec des complications telles que la neurorétinite pour laquelle un traitement antimicrobien spécifique peut être nécessaire Le diagnostic de laboratoire de CSD reste problématique. autorisé pour une utilisation de routine Autre test de diagnostic s ont besoin de procédures invasives pour obtenir du pus ou du tissu des ganglions lymphatiques affectés ou d’autres organes, et sont soit de faible sensibilité Bartonella henselae culture, Warthin Starry coloration d’argent, faible cytologie de spécificité, histopathologie, ou de disponibilité limitée dans les laboratoires de diagnostic de routine PCR, immunohistochimique In, Regnery et al ont décrit un test immunofluorescent par immunofluorescence IFA pour la détection d’IgG anti-B henselae. Ce test présentait une sensibilité de% et une spécificité de%. Depuis lors, ce test IFA est devenu le plus utilisé test de diagnostic des CSD, à la fois comme produits internes et commerciaux Ce test présente toutefois plusieurs limites La préparation de l’antigène nécessite la culture de B henselae dans des cellules Vero Les tentatives d’utilisation d’antigènes dérivés d’agar entraînent une autoagglutination des bacilles B henselae , qui interfère avec les tests IFA Le test IFA a été développé principalement pour la détection des IgG anti-B henselae; Nos données concernant les IgM anti-B henselae sont limitées. En outre, les tests IFA en général souffrent de variations inter-observateurs et ne conviennent pas non plus à l’automatisation ou au criblage d’un grand nombre de spécimens. IFA ou ont été faussés en ne fournissant pas suffisamment de données pour évaluer le test ou pour interpréter sa sensibilité et sa spécificité In, une étude de surveillance CSD israélienne a été entamée Le test cutané était le seul test de confirmation disponible à cette époque. Les tests sérologiques et de PCR ont été progressivement remplacés dans la plupart des cas. Dans cette étude, nous décrivons les résultats de l’EIA IgM et IgG. ayant utilisé un antigène de B henselae cultivé en gélose chez des patients présentant un diagnostic définitif de CSD

Patients et méthodes

Les laboratoires communautaires et hospitaliers ont été contactés, le cas échéant, pour obtenir des rapports histopathologiques, cytologiques et microbiologiques de biopsies ganglionnaires ou d’aspirations.CASD définition de cas Un cas de CSD a été défini comme un patient avec lymphadénite régionale et antécédents de contact avec le chat récent et au moins un test de confirmation positif: test de PCR, test cutané ou culture de B henselae, le tout en l’absence d’un autre diagnostic Sur la base de cette définition, les patients Le groupe de contrôle était constitué de patients dont les échantillons de sérum étaient dirigés vers le centre médical de Tel Aviv parce qu’ils étaient suspectés d’être atteints de CSD, mais ont finalement été diagnostiqués avec d’autres diagnostics. les patients du groupe CSD, les données démographiques, épidémiologiques et cliniques étaient également Le groupe témoin était composé de patients séropositifs pour des infections autres que les CSD, communément associées à une lymphadénopathie, pour lesquels des échantillons de sérum stockés étaient disponibles: les patients avaient une infection aiguë par le virus Epstein-Barr EBV, une infection aiguë au cytomégalovirus CMV et Préparation de l’antigène pour CSD EIA Antigen pour EIA a été préparé comme décrit précédemment par Welch et al avec quelques modifications B henselae – ATCC a été cultivé pendant – jours sur des plaques de gélose au chocolat à ° C en% CO Bactéries ont été récoltées en mp HEPES N– L’acide hydroxyéthylpipérazine-N ‘- éthanesulfonique, pH Sigma et soniqué sur de la glace Le lysat a été centrifugé à, g pendant min à ° C, et le surnageant a été transféré dans de nouveaux tubes et centrifugé pendant un autre min. et μL de% N-lauroyl-sarcosine dans un tampon HEPES, puis placés sur de la glace pendant h. Après une autre centrifugation pendant min, le culot a été rincé deux fois avec mM H EPES, remis en suspension dans – μL tampon d’électrophorèse fraîchement préparé et stocké en aliquots de -μL à-° C jusqu’à utilisation La concentration en protéine a été déterminée par la méthode de Bradford Bio-RadCSD EIA Un échantillon d’antigène contenant ng de protéine dans un tampon carbonate-bicarbonate On a ajouté du pH Sigma à chaque puits approprié d’une plaque ELISA à fond plat. On a lavé la plaque Immuno NUNC, la surface MaxiSorp, les plaques Nunc A / S, on a bloqué avec% de sérumalbumine bovine dans du PBS avec du Tween PBST, incubé pendant min. Les échantillons de sérum ont été dilués: dans du PBST, incubés pendant min, et lavés avec du PBST. On a ajouté 100 pi d’IgG ou d’IgM de chèvre anti-humaine conjuguée à de la phosphatase alcaline à: et: une dilution, respectivement. On a ajouté du p-Nitrophényl phosphate Sigma et on a laissé incuber à température ambiante jusqu’à ce que les échantillons de sérum témoin IgG et IgM positifs atteignent une densité optique DO de et, respectivement, à nm, évaluée par un n lecteur ELISA automatique Tous les échantillons ont été testés en trois exemplaires. Les valeurs moyennes de lecture et d’écart type pour les échantillons sériques du groupe de contrôle des donneurs de sang ont été déterminées et dirigées vers l’établissement de valeurs seuils pour les résultats positifs. absence de test IFA d’antigène nucléaire anti-EBV; Gull Laboratories, ELISA de capture d’IgM anti-CMV, Vironostika anti-CMV II; Organon Teknika, et ELISA anti-Toxoplasma capture IgM, Captia Toxo M, Trinity Biotech avec test positif Sabin Feldman ont été utilisés comme critères pour le diagnostic de l’infection aiguë EBV, CMV et Toxoplasma, respectivement Tous les échantillons de sérum ont été testés au Centre médical de Tel Aviv ceux des patients atteints de toxoplasmose, qui ont été testés au Laboratoire de référence Toxoplasma, Laboratoires nationaux de santé publique, Ministère de la Santé, essai IsraelPCR Amplification d’une partie du gène B henselae gltA, codant pour la citrate synthase, suivie d’une analyse du polymorphisme TaqI enzyme de restriction, a été réalisée comme décrit précédemment PCR a été réalisée sur pus aspirats, des échantillons d’aspiration à l’aiguille fine, ou des biopsies de ganglions lymphatiques touchés test de peau a été réalisée sur des patients sélectionnés comme décrit précédemment spécimens utilisés pour les tests cutanésCultures microbiologiques Chaque fois que suffisamment de matériel était disponible, Les microsphères de ganglions lymphatiques ou de pus ont été dispersées dans du PBS pH, étalées sur des plaques de gélose au chocolat, scellées avec des bandes de scellage rétractable Remel et incubées à ° C en% CO pendant – semaines B henselae a été identifié par coloration de Gram, réactions biochimiques, et PCR Les bactéries et les mycobactéries ont été identifiées par des méthodes bactériologiques standard. Analyse statistique Les différences entre les groupes ont été analysées avec le test or ou le test exact de Fisher pour les variables catégorielles et avec le test de Student ou le test de Mann-Whitney. ; était considéré comme significatif

Résultats

Les caractéristiques des CSD n = et du groupe témoin n = patients sont présentées dans le tableau Il n’y avait pas de différence significative d’âge, de sexe et de présence de fièvre ou de malaise entre les groupes. % du groupe CSD, comme l’exigeait la définition de cas du groupe CSD Il n’y avait pas de différence significative dans la localisation des ganglions lymphatiques affectés sauf pour la localisation épitrochléaire, qui était retrouvée chez les patients atteints de CSD et chez aucun groupe témoin P = Comme attendu , les diagnostics histopathologiques de lymphadénite nécrosante ou de lymphadénite granulomateuse nécrosante étaient significativement plus fréquents dans le groupe CSD P & lt; La PCR a été réalisée chez des patients atteints de CSD et était positive chez tous Les tests cutanés positifs chez des patients atteints de CSD testés Quatre patients positifs au test cutané avec CSD ont également eu un pus PCR positif ou un ganglion lymphatique n’a pas été réalisé dans les autres tests cutanés des patients positifs avec CSD Seule la culture des tentatives a produit une croissance de B henselae dans le groupe CSD L’intervalle médian entre l’apparition des symptômes et le prélèvement du premier échantillon de sérum était de plusieurs semaines dans le groupe CSD, – semaines et dans le groupe témoin, – semaines

Tableau View largeDownload slideCaractéristiques de la maladie du chat-scratch Groupe CSD et patients du groupe témoinTable View largeDownload slideCaractéristiques de la maladie du chat-scratch Groupe CSD et patients du groupe contrôleFigure et présente la distribution des titres IgG et IgM anti-B henselae respectivement dans la CSD et le contrôle La DO moyenne et le SD ont été respectivement et respectivement IgG et et IgM. Un échantillon sérique a été considéré positif si la DO moyenne était supérieure ou égale à la valeur moyenne pour les échantillons sériques du groupe de contrôle des donneurs de sang pour IgG, une catégorie intermédiaire a été utilisée pour les échantillons de sérum avec une DO de lecture ≥ SD mais & lt; SD Seule une sérologie positive et non intermédiaire a été considérée comme diagnostique et a été utilisée pour calculer les sensibilités

Figure Vue largeDownload slideDistribution des titres d’IgG anti-Bartonella henselae, exprimés en DO de densité optique, dans la CDD et les groupes témoins Chaque diamant représente le patient Le point de coupure pour un test positif est indiqué arrowFigure View largeDownload slideDistribution de l’anti-Bartonella Titres d’IgG d’henselae, exprimés en tant que valeurs de DO de densité optique, dans la CSD de la maladie des griffes de chat et les groupes témoins Chaque diamant représente le patient Le point de coupure pour un test positif est indiqué par une flèche

Figure Vue largeDownload slideDistribution des titres IgM anti-Bartonella henselae, exprimés en valeurs DO de densité optique, dans la maladie CDD et les groupes témoins Chaque diamant représente le patient Le point de coupure pour un test positif est indiqué arrowFigure View largeDownload slideDistribution de l’anti-Bartonella Titres d’IgM d’henselae, exprimés en DO de densité optique, dans la CDD et les groupes témoins Chaque losange représente le patient Le point de coupure pour un test positif est indiqué par l’utilisation du groupe témoin SD comme seuil, anti-B henselae IgG Les IgG et IgM ont été détectées chez les patients, les IgG sans IgM chez les patients et les IgM seules chez les patients. La sensibilité EIA a donc été calculée en% et en% pour les IgG et IgM, respectivement. positif, IgM-positif, ou les deux réactions ont été utilisés pour diagnostiquer CSD, la sensibilité a augmenté à% Il y avait des échantillons de sérum appariés Le temps médian entre Le premier échantillon de sérum était IgG positif chez les patients%, et un autre% était séropositif lors de l’évaluation des échantillons suivants, ce qui donne un% de sensibilité pour les IgG. La sensibilité était de% pour les IgM. La positivité des IgG, la positivité des IgM ou les deux ont été utilisées pour diagnostiquer les CSD. Des échantillons sériques appariés étaient disponibles uniquement pour les patients séronégatifs atteints de CSD. En fait, la sensibilité de l’EIA aurait pu être plus élevée si les échantillons de sérum appariés Parmi le groupe de contrôle des prélèvements sanguins donneurs de sang,% présentaient des anticorps anti-B henselae IgG positifs et% IgM positifs, ce qui correspond à la manière dont le seuil a été défini en utilisant ce groupe témoin. Aucun sérum échantillons dans le groupe témoin et aucun des échantillons dans le groupe témoin étaient positifs pour IgG ou IgM Deux patients dans le groupe témoin – avec lymphadénopathie cervicale secondaire à nasopharynge Les titres IgG anti-B henselae ont été interprétés comme intermédiaires. Sur la base de résultats positifs dans chacun des groupes témoins, la spécificité pour IgG et IgM a été calculée pour être respectivement de% -% et% -%. Groupe CSD, lorsque les patients séropositifs et séronégatifs ont été comparés, aucune différence significative n’a été trouvée dans l’âge, le sexe, la présentation clinique, le traitement antibiotique ou l’intervalle de temps entre l’apparition des symptômes et l’échantillonnage du premier échantillon sérique. la sensibilité moyenne du SD et de l’EIA serait calculée en% et en% pour les IgG et IgM, respectivement. Lorsque les réactions IgG-positives, IgM-positives ou les deux sont utilisées pour diagnostiquer la CSD à ce niveau de détection, la sensibilité augmenterait légèrement Toutefois, une telle augmentation de la sensibilité se produirait au détriment de la spécificité réduite dans le groupe témoin de% à% au lieu de séropositif c ases, et dans le groupe de contrôle de% à% au lieu de cas séropositifs, la spécificité IgG pour le groupe témoin et la spécificité IgM pour les groupes témoins resterait inchangée

Discussion

Drancourt et al ont pu augmenter la sensibilité de leur test IFA en incorporant un nouveau variant de B henselae dans leur test. Cependant, lorsque nous avons effectué EIA avec des antigènes extraits de CSD isolats israéliens de B henselae La découverte que l’IgM anti-B henselae peut être détectée sans réponse d’IgG associée a été décrite précédemment Comme la réponse IgM est de courte durée, il peut être manqué si les échantillons de sérum sont pas assez tôt dans l’évolution de la maladie, comme cela se produit souvent dans les CSD, où la lymphadénopathie peut persister plusieurs mois Ceci peut expliquer, au moins en partie, la sensibilité plus faible de l’EIA IgM dans notre étude où les premiers échantillons de sérum ont été prélevés Des semaines et des semaines après le début de la maladie. Selon des critères stricts, l ‘EIA était hautement spécifique,% -% et% -% pour les IgG et les IgM, respectivement. Les groupes témoins et les patients du groupe contrôle ont été cliniquement soupçonnés par leurs médecins d’être atteints de SDR, et% d’entre eux avaient des antécédents de contact avec les chats. Cependant, finalement, ils ont tous été diagnostiqués comme ayant autres maladies, y compris les maladies infectieuses malignes et non-CSD Aucun de ces patients ne présentait d’IgG ou d’IgM positives selon des critères rigoureux, mais les patients avaient des IgG intermédiaires, peut-être à la suite d’une infection antérieure par le groupe B henselae Control. Zbinden et al ont rapporté que des échantillons sériques de patients présentant des IgM à EBV présentaient des réactions croisées contre B henselae lors d’un test IFA. les patients du groupe témoin, y compris ceux qui présentaient une infection aiguë par l’EBV, se sont révélés positifs à l’égard de l’IgM anti-B henselae ou de l’IgGWe choisis pour utiliser une valeur seuil élevée la valeur pour les résultats positifs signifie OD DO plus SD parce que nous croyons que la spécificité d’un test sérologique devrait être élevée lors du diagnostic d’une maladie qui peut imiter cliniquement un processus malin ou une infection mycobactérienne. Avons-nous utilisé un seuil inférieur? SD, ou le percentile du groupe témoin, comme dans d’autres études , échantillons de sérum provenant des patients du groupe contrôle, un avec carcinome nasopharyngé, et un avec lymphadénite mycobactérienne non tuberculeuse, aurait été interprété comme IgG positif, suggérant CSDLa performance du test IFA varie selon les études. Dans les études où il a été réalisé au Centers for Disease Control et Prevention en utilisant la méthode de Regnery et al , avec un titre réciproque de ≥ comme valeur seuil, les deux sensibilité% -% et la spécificité% -% pour détecter les IgG anti-B henselae étaient élevées Cette méthode, cependant, n’a pas été conçue pour détecter les anticorps IgM anti-B henselae [-,] Résultats de la FI Un test était incohérent et moins satisfaisant dans les études réalisées en Europe Dans une étude française , les échantillons sériques étaient positifs à un titre réciproque de ≥ chez seulement% des patients suspectés d’être atteints d’une CSD. sensibilité de% -% et% -% pour les IgG et IgM, respectivement, chez les patients qui avaient probablement une CSD lorsque des valeurs seuils de ≥ pour l’IFG IgG avec antigène dérivé des cellules Vero et ≥ pour l’antigène dérivé de gélose ont été utilisées. qui a utilisé un titre réciproque de ≥ comme IgG positive , a trouvé une séroprévalence élevée parmi les propriétaires de chats% et les témoins sains qui ne possédaient pas de chats%, indiquant une faible spécificité pour le diagnostic de CSD Une étude réalisée en Suisse a rapporté une faible spécificité % et% lors de l’évaluation des lames commerciales avec B henselae dérivé de l’agar comme antigène Une lame commerciale avec l’antigène dérivé de cellules Vero avait une sensibilité de% et une spécificité de% pour le titre d’IgG réciproque lors d’un test chez un patient suspecté s avec CSD et donneurs de sang Une autre étude allemande a comparé les tests commerciaux IFA et a trouvé que les deux tests étaient très sensibles aux IgG au détriment d’une très faible spécificité de% et de%. Les sensibilités pour les IgM étaient% et%, et les spécificités % et% dans les tests Il est possible qu’une séroprévalence élevée d’IgG anti-B henselae en Europe due à une exposition à des espèces non-henselae Bartonella entraîne une performance inférieure à celle du test IFA comparé aux Etats-Unis. Il serait intrigant de comparer L’EIE décrite dans cette étude peut jouer un rôle important dans le sérodiagnostic des CSD L’amélioration de la sensibilité, en particulier celle de l’IgM, serait souhaitable. Pour mieux comprendre la cinétique de l’anticorps réponse dans les CSD, et pour améliorer notre capacité à interpréter les résultats du test, nous menons actuellement une étude clinique et sérologique prospective à long terme. Etude de suivi des patients atteints de CSD