Détection et identification de micro-organismes par amplification et séquençage de gènes

Détection et identification de micro-organismes par amplification et séquençage de gènes

L’amplification et le séquençage des gènes ont permis de découvrir de nouveaux agents pathogènes et de mieux classer les micro-organismes de la culture. L’identification séquentielle des bactéries et des champignons par culture est plus objective et précise que les méthodes conventionnelles, en particulier pour la classification de micro-organismes inhabituels pathogènes émergents chez les hôtes immunocompromis Bien qu’un outil puissant, l’interprétation de la classification séquentielle peut être difficile car la taxonomie microbienne devient plus complexe, sans corrélats cliniques connus. De plus, la réaction en chaîne du gène polymérase à large spectre et le séquençage ont émergé comme alternative. des méthodes indépendantes pour détecter les agents pathogènes du matériel clinique La promesse de cette technique est restée forte, limitée principalement par la contamination et les problèmes de sensibilité inadéquats Cette revue explique la classification microbienne basée sur les séquences, en mettant l’accent sur le lien entre le monde complexe de la taxonomie microbienne. De plus, cette revue discute d’une approche rationnelle de la réaction en chaîne de la polymérase bactérienne à large spectre et du séquençage des gènes lorsqu’elle est appliquée directement aux échantillons cliniques.

L’amplification génique et le séquençage de cibles génétiques à large spectre pour les bactéries et les champignons sont devenus des outils importants pour diagnostiquer les infections. Au cours de la dernière décennie, les laboratoires cliniques ont appliqué l’amplification PCR et le séquençage des gènes pour caractériser les microorganismes de la culture. échantillons de patients Le séquençage génétique est une méthode plus précise et reproductible pour identifier les microorganismes et a augmenté notre capacité à capturer la diversité des taxons microbiens Cette nouvelle technologie a permis l’identification de micro-organismes inhabituels et la détection de nouveaux Cependant, les cliniciens sont maintenant confrontés à l’interprétation de rapports microbiologiques qui comprennent des taxons qui ne sont pas familiers et ne peuvent être assimilés dans un cadre clinique significatif. Aussi, l’application de la PCR bactérienne et fongique à large spectre directement à partir de le matériel est maintenant plus largement disponible, en changeant de Cette étude décrit l’identification des bactéries et des champignons à l’aide de séquences, en mettant l’accent sur l’amélioration de notre compréhension du monde de plus en plus complexe de la taxonomie microbienne en relation avec le contexte clinique. PCR bactérienne à l’échelle et séquençage des gènes appliqués directement aux échantillons cliniques

Sélection de cibles génétiques

Pour les bactéries, les mycobactéries et les champignons, de nombreuses cibles génétiques ont été reconnues comme des outils utiles pour l’identification. Les cibles génétiques à large spectre des virus n’ont pas été développées, en raison de leur plus grande diversité génétique et de notre incapacité à trouver un lien génétique commun. sont sélectionnés doivent être fonctionnellement constants, servant d’horloges moléculaires de changement évolutif microbien phylogénie Le gène doit avoir un segment conservé qui est commun à toutes les bactéries ou champignons et qui est flanqué de régions variables ou très variables Les régions conservées sont responsables de « l’universalité » Au cours du séquençage, des régions variables ou très variables génèrent des fragments de bases nucléotidiques uniques ou des séquences qui servent de «signatures» à différentes espèces. La séquence est ensuite comparée à des séquences de référence déposées en public ou en bibliothèques de séquences privées pour déterminer la parenté Le degré acceptable de di Les méthodes de classification des bactéries sont basées sur les caractéristiques observées dans des souches connues avec des propriétés biochimiques et physiques prévisibles dans des conditions de croissance optimales. conditions Lorsque des microorganismes communs présentent des phénotypes rares, le recours au phénotype peut compromettre l’identification précise L’identification par séquençage génétique est plus objective, n’exige pas de croissance optimale ou même un micro-organisme viable et a la capacité de définir des relations taxonomiques le plus couramment utilisé pour l’identification bactérienne est l’ARNr S ou SADN, un gène de paire de base qui code pour une partie de la figure du ribosome S Le séquençage du gène de l’ARNr de la paire S de base partielle a émergé comme une méthode plus précise et plus rapide grande variété de bactéries aérobies et anaérobies et h Les bactéries peuvent avoir une seule copie ou des copies multiples de ce gène, ce qui peut compliquer l’interprétation lorsque des changements de paires de bases existent entre les copies. À l’inverse, plusieurs copies peuvent être utiles pour améliorer la sensibilité. d’amplification par PCR, en particulier lors de l’application directe de cette technologie à partir d’échantillons cliniques Une des principales limites de la séquence ADNr S est son incapacité à discriminer tous les taxons bactériens. Par exemple, Bacillus cereus et Bacillus anthracis ont des séquences identiques d’ADN ribosomique. séparés par leur ADN génomique, car leurs différences résident principalement dans l’acquisition de plasmides de virulence. Pour d’autres micro-organismes partageant une identité de séquence complète, d’autres cibles génétiques peuvent fournir une meilleure séparation des espèces étroitement apparentées. Le gène rpoB, un gène qui code la sous-unité β de l’ARN polymérase bactérienne, est une cible de gènes précieux Lorsque les résultats du séquençage du gène ARNr partiel S ne peuvent pas discriminer entre les taxons En outre, les données de séquence rpoB sont plus simples, sans variantes de copie, parce que les bactéries ont seulement copie de ce gène Le gène rpoB a été particulièrement utile pour l’identification des mycobactéries à croissance rapide, tels Mycobacterium chelonae et Mycobacterium abscessus Ces espèces ont des séquences d’ADNr S indistinguables, mais présentent une divergence de séquence de plus de 2% avec rpoB D’autres cibles de gènes bactériens qui peuvent fournir une meilleure séparation de certaines espèces comprennent le facteur d’élongation Tu, gyrA ou gyrB gyrase A ou B superoxyde dismutase dépendante du manganèse et protéines de choc thermique

Figure Vue largeDownload schemaA pour un ARN ribosomique s gène de la paire de ~, situé sur la petite sous-unité ribosomale S Les cercles représentent des régions conservées qui servent de cibles génétiques pour l’amplification PCR et le séquençage de l’ADN des bactéries. Les cercles représentent les régions conservées qui servent de cibles génétiques pour l’amplification par PCR et le séquençage de l’ADN des bactériesFungi Similaire aux bactéries, l’identification classique des champignons nécessite des tests biochimiques et une expertise dans la reconnaissance de la morphologie des structures reproductrices fongiques macroscopiquement et l’identification microscopique par séquençage génétique ne nécessite pas d’organisme viable ou de moisissures de sporulation, permettant un diagnostic plus rapide. Les cibles géniques pour l’identification des levures et des champignons médicalement importants ne sont pas aussi bien codifiées que pour les bactéries. ITS, qui sont v La région ITS s’est avérée utile pour l’identification des levures, telles que les espèces Candida, Cryptococcus, Trichosporon et Aspergillus; les zygomycètes; moules dématiés; Les régions ITS ont des limites, et d’autres cibles géniques sont souvent nécessaires pour identifier certains genres, tels que les domaines D et D de la sous-unité S rRNA , le facteur d’élongation α, par exemple, les espèces Fusarium, et β -tabuline, par exemple, espèces de Phaeoacremonium

Figure Vue largeDownload slideFungal Régions ITS entre les gènes des petites et grandes sous-unités d’ADNr Les cercles représentent les régions conservées en dehors des régions ITS et ITS qui servent de cibles génétiques pour l’amplification PCR et le séquençage de l’ADN des champignons. et grandes sous-unités d’ADNr Les cercles représentent des régions conservées en dehors des régions variables ITS et ITS qui servent de cibles génétiques pour l’amplification par PCR et le séquençage d’ADN de champignons

Interprétation des séquences génétiques de la culture pure

La classification précise des séquences géniques d’un genre ou d’une espèce nécessite une analyse avec une bibliothèque de référence complète et de qualité MicroSeq, GenBank, le projet de base de données ribosomique, la différenciation ribosomale des microorganismes et SmartGene sont tous des bases de données utiles. Par exemple, GenBank est une grande base de données publique avec des séquences d’ADN ribosomiques S, avec la limitation de moins d’oubli entraînant des séquences de référence de mauvaise qualité. MicroSeq Applied Biosystems est une bibliothèque de séquences de référence établie et disponible dans le commerce avec des séquences d’ADNr les souches de microorganismes, qui peuvent fournir des données de séquence de meilleure qualité, doivent être utilisées avec prudence, car l’utilisation d’une souche unique pour représenter des taxons entiers est souvent inadéquate Les bases de données de référence sont les plus importantes pour les SADN et les séquences ITS / fongiques. les cibles génétiques augmentent rapidementLes séquences nucléotidiques sont généralement signalées en termes de «pourcentage d’identité» Ce terme désigne le nombre de bases nucléotidiques identiques partagées par les séquences de requête et de référence divisées par le nombre de bases nucléotidiques séquencées. Figure est un exemple de rapport généré pour le micro-organisme Acinetobacter baumannii. établir des critères sur la base de pourcentages d’identité pour classer les microorganismes selon leurs genres respectifs par séquençage, en particulier pour les champignons Pour les bactéries identifiées par le gène ARNr S, la plupart des taxonomistes acceptent un score d’identité de ≥% et ≥% pour classer un microorganisme Par exemple, la classification basée sur les séquences diffère pour les espèces de Mycobactéries, en grande partie à cause de leur homologie dans le S ARNr. région, et une séquence doit partager au moins% identité avec la référence pluie pour l’identification des espèces Les pourcentages d’identité pour la classification du genre et des espèces varient également en fonction des différentes cibles génétiques Les espèces de Mycobacterium séquencées à partir de recA et rpoB peuvent être classées en espèces distinctes partageant seulement% -% identité

Figure Vue largeTélécharger la diapositiveRéprésentation des scores d’identité de la base de données de différenciation ribosomale des microorganismes La requête isoler partage% identité avec Acinetobacter baumannii Le score Smith-Waterman évalue la parenté sur la base du nombre de bases alignées et pour cent identityFigure Le score de Smith-Waterman évalue la parenté sur la base du nombre de bases alignées et du pourcentage d’identité. Les défis se posent lorsque les micro-organismes ne peuvent pas être discriminés par le séquençage du gène de l’ARN ribosomique. Streptococcus mitis groupe, qui comprennent Streptococcus pneumoniae, ont des séquences de gènes ARNr S indiscernables, le partage entre% -% identités lorsqu’ils sont alignés figure A La similarité de séquence peut être évaluée plus loin en construisant un diagramme de parenté arbre phylogénétique qui Les figures B et C montrent des arbres phylogénétiques pour le groupe Streptocococcus mitis, créés à la fois avec les séquences du gène ARNt et du gène tuf. Pour ce groupe de microorganismes, le gène tuf présente une plus grande divergence de séquence et fournit ainsi une meilleure séparation. espèces pour une classification plus précise basée sur les séquences D’autres cibles génétiques sont également utiles pour l’identification de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis et Bordetella bronchiseptica; Neisseria meningitidis et Neisseria cinerea; et Escherichia coli et Shigella dans lesquelles chaque groupe a des séquences de gènes ARNr S indiscernables

Vue de la figure largeDownload slideA, chaque base nucléotidique de la séquence d’interrogation comparée à la séquence de référence en alignant les séquences avec le séquençage partiel du gène S rRNA, Streptococcus mitis et Streptococcus pneumoniae ne diffèrent que par les paires de bases, alors qu’avec le séquençage du gène tuf, ces paires B et C, matrices de distances issues d’arbres phylogénétiques calculés par diverses méthodes Généralement, l’association entre séquences peut être calculée en additionnant leurs distances horizontales Pour S mitis et S pneumoniae, la distance horizontale calculée sur l’arbre S rRNA est faible, comparée au gène tuf Chaque image nucléotidique de la séquence d’interrogation comparée à la séquence de référence en alignant les séquences avec le séquençage partiel du gène de l’ARNr S, Streptococcus mitis et Streptococcus pneumoniae ne diffèrent que par des paires de bases, alors qu’avec le séquençage des gènes tuf, ces organismes diffèrent par ba paires de B et C, matrices de distance d’arbres phylogénétiques calculés par diverses méthodes Généralement, l’association entre les séquences peut être calculée en ajoutant leurs distances horizontales Pour S Mitis et S pneumoniae, la distance horizontale calculée sur S arbre ARNr est petite, comparée à Tuf Le séquençage génétique nous a permis d’identifier des microorganismes nouveaux et moins courants qui sont des agents de la maladie humaine. On ne sait pas si ces microorganismes inhabituels sont apparus comme de nouveaux pathogènes humains ou s’ils ont été des agents de la maladie humaine. qui ont été précédemment mal classés par des méthodes conventionnelles Un cas de bactériémie de l’espèce Devosia, un bacille gram négatif, peut en fait être la première description de ce micro-organisme causant une maladie humaine, mais sans séquençage du gène S rRNA, cette bactérie aurait pu être classée par des méthodes conventionnelles comme une tige gram-négative environnementale ou une espèce de Pseudomonas Interpréter des rapports microbiologiques avec des taxons non familiers est difficile, surtout quand nous sommes incapables d’associer ces microorganismes à des syndromes cliniques particuliers. Par exemple, les espèces d’Helcococcus identifiées dans le fluide articulaire en utilisant le séquençage peuvent être classées comme un groupe viridans Streptococcus species en utilisant des méthodes conventionnelles. d’un genre inconnu, comme l’espèce Helcococcus, est plus important qu’un rapport sur les streptocoques du groupe des viridans, pour lesquels les cliniciens ont une expérience clinique associative. De même, les laboratoires cliniques devraient appliquer le séquençage des gènes pour une identification microbienne prudente et judicieuse. les diphthéroïdes ne doivent pas être séquencés régulièrement pour l’identification, car les cliniciens peuvent déduire du résultat du séquençage, Leifsonia aquaticum anciennement une partie du genre Corynebacterium, que ce microorganisme est un nouveau pathogène avec une forte probabilité de causer la maladie, ce qui est un faux déduire l’inférence Lorsque des taxons inhabituels sont signalés par séquençage génétique, nous proposons que les laboratoires cliniques fournissent des informations supplémentaires pour aider les cliniciens à placer de nouvelles espèces dans un cadre microbien plus familier.

Figure Vue largeDownload slideReporting d’espèces nouvelles utilisant des arbres phylogénétiques Une espèce inhabituelle, Tannerella forsythensis, peut être rapportée dans un cadre qui montre sa relation avec des anaérobies plus connus. Voir en grand formatTélécharger une lameRapport d’espèces nouvelles utilisant des arbres phylogénétiques Une espèce inhabituelle, Tannerella forsythensis, peut être Dans l’ensemble, l’identification basée sur la séquence de la culture est un outil extrêmement précieux, en particulier pour classer les micro-organismes inhabituels qui sont des pathogènes émergents chez les hôtes immunocompromis Avec le séquençage du gène S rRNA, nous avons été en mesure de identifier Inquinilus limosus à partir d’échantillons respiratoires, un agent pathogène connu chez les patients atteints de fibrose kystique Pour les champignons, une meilleure caractérisation des zygomycètes par séquençage ITS peut être extrêmement utile pour mieux prédire l’activité antifongique, qui varie entre les genres Enfin, l’identification microbienne par le séquençage des gènes a amélioré notre capacité à reconnaître de nouveaux agents pathogènes émergents et à mieux définir les relations taxonomiques, ce qui pourrait nous aider à mieux comprendre la pathogenèse microbienne

Applications pour échantillons cliniques

L’incidence de l’endocardite infectieuse culture-négative reste élevée et, dans l’espoir de mieux définir les agents étiologiques responsables de cette maladie, les bactéries à large spectre seront étudiées. La PCR a été appliquée à des échantillons de sang, hémocultures et valvules cardiaques provenant de patients atteints de cette maladie Bien que l’utilisation de la PCR à large spectre pour les patients atteints d’endocardite puisse être utile, des résultats de PCR faussement négatifs Les résultats de la culture sont positifs Dans une étude chez des patients subissant une résection de valvule cardiaque pour une endocardite positive et négative , la PCR a échoué à détecter des cas d’endocardite streptococcique de groupe viridans, tandis que la culture n’a pas retrouvé T whipplei. résultats de culture de sang et de valve, la PCR était positive pour streptocoques du groupe viridans, mais gram-positive c occi ont été trouvés sur la coloration de Gram de la valve réséquée Une étude similaire a trouvé un additif PCR à large spectre pour les patients atteints d’endocardite à Bartonella quintana et ceux recevant des traitements prolongés de traitement antimicrobien avant l’excision valvulaire Les rapports de contamination PCR et sa spécificité sont variables. les cliniciens doivent interpréter avec prudence les résultats de PCR positifs, en particulier en l’absence de preuves histologiques d’endocardite Globalement, les méthodes de PCR bactériennes à large spectre se sont avérées utiles pour le diagnostic d’endocardite lorsqu’ils sont appliqués sur des échantillons sanguins ou des valvules. recevant déjà un traitement antimicrobien, avec histologie positive, ou pour une maladie causée par des agents pathogènes exigeants, par exemple espèces Bartonella et Coxiella burnetii Méningite et abcès cérébral La PCR bactérienne à large spectre a été appliquée aux échantillons de LCR, avec des résultats similaires à ceux des échantillons sanguins et des ADN bactériens la contamination et la sensibilité restent problématiques Dans une étude prospective des patients atteints de méningite dans leur diagnostic différentiel, la PCR S-ADN avait une sensibilité de%, spécificité de%, valeur prédictive positive de%, et valeur prédictive négative de% Pour les patients avec des résultats de culture positifs cliniquement significatifs avec N meningitidis, avec Listeria monocytogenes, et avec les espèces Pantoae, les résultats de la PCR étaient négatifs. Des patients ayant une culture négative et des résultats positifs à la PCR ont reçu un traitement antibactérien avant la collecte des échantillons. Ces résultats reflètent à nouveau les avantages des méthodes moléculaires. Nous avons expérimenté des cas dans lesquels la coloration de Gram de l’abcès a démontré des cocci Gram positif avec des résultats de culture négatifs S ARNr amplification et séquençage groupe de Streptococcus anginosus détecté dans des échantillons obtenus à Encore une fois, la PCR bactérienne à large spectre devrait être utilisée comme méthode adjuvante pour le diagnostic de la méningite et des abcès cérébraux lorsque la présentation clinique et les résultats de laboratoire, par exemple les paramètres du LCR, la coloration de Gram et les colorations histologiques suggèrent une étiologie bactérienne. pour être utile, en particulier pour les patients qui ont reçu un traitement antibactérien au moment de la collecte des échantillons, lorsque les résultats de culture restent négatifs. Infections osseuses et articulaires Les agents étiologiques de l’ostéomyélite, de l’arthrite septique et des infections articulaires prothétiques sont souvent difficiles à cultiver médian. La valeur de la PCR à large spectre a été largement étudiée dans ce domaine, et contrairement à l’obtention de spécimens de sang ou de liquide céphalo-rachidien, l’extraction de l’ADN bactérien dans les tissus osseux et articulaires présente de nombreux défis Perturbation du biofilm, qui se développe chez les patients avec des implants orthopédiques, peut être difficile, mais il est essentiel de libérer Dans une étude récente sur les infections ostéoarticulaires, les méthodes d’ADNr S ont détecté des pathogènes dans les cas où les résultats de culture étaient négatifs, les patients ayant déjà reçu un traitement antibactérien Inversement, dans les cas de culture- infection à S aureus positif, résultats de PCR bactériens à large spectre négatifs Des résultats faussement positifs ont été obtenus pour la culture et la PCR à large spectre, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes et Pseudomonas aeruginosa étant les contaminants PCR les plus courants chez les patients atteints d’arthrite septique, La PCR bactérienne à large spectre n’a pas non plus été prouvée supérieure aux méthodes conventionnelles La PCR peut s’avérer utile dans certains cas d’infections osseuses et des tissus mous chez des patients ayant déjà reçu un traitement antibactérien, lorsque des pathogènes exigeants sont soupçonnés, par exemple. Streptobacillus moniloformis et Kingella kingae chez les enfants ou lorsque le pathogène est incultivable, par exemple, Borrelia burgdorfe ri

Conclusions

L’amplification et le séquençage des gènes ont permis la découverte de nouveaux agents pathogènes et ont permis de mieux classifier les micro-organismes de la culture. L’émergence de micro-organismes plus inhabituels peut représenter de nouveaux pathogènes humains ou refléter notre expertise évolutive de la taxonomie microbienne des espèces, L’application directe de la PCR bactérienne à large spectre à des échantillons cliniques est un outil d’appoint important pour la culture. Elle s’est révélée utile dans certains contextes cliniques lorsque les résultats de la culture restent négatifs et que les résultats sont négatifs. suspicion clinique d’infection reste élevée, PCR à large spectre est extrêmement utile, en particulier lorsque les taches histologiques donnent des résultats positifs, les patients ont reçu un traitement antimicrobien avant la collecte des échantillons, ou les agents probables sont pathogènes ou incultivables pathogènes Globalement, l’amplification génique et le séquençage de la culture et le matériel clinique peut je améliorer notre compréhension de la pathogenèse microbienne et mieux prédire les réponses à la thérapie et les résultats

Remerciements

Je remercie le Dr Kenneth H Wilson pour ses discussions perspicaces et son examen attentif de ce manuscrit. Je remercie également Keith Simmon pour son assistance technique et illustrations chiffrées. Conflits d’intérêts potentiels CAP a été consulté pour Diagnostic Hybrids et a siégé au bureau du conférencier pour Gilead